人Era蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其純化

1、人Era蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其純化         07-08-23 11:43:00     編輯：studa20          作者：吳元明，陳蘇民，陳南春，紀(jì)宗玲，劉惠萍，張俊杰【關(guān)鍵詞】  人Era基因關(guān)鍵詞: 人Era基因;基因表達(dá);蛋白純化 摘 要:目的  在大腸桿菌中對(duì)人的era基因（簡(jiǎn)稱hera）進(jìn)行表達(dá)、純化. 方法  PCR擴(kuò)

2、增hera基因，測(cè)序正確后克隆入大腸桿菌融合表達(dá)載體pRSET-C，重組質(zhì)粒pRSETC-hera以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).然后利用親和層析的方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化. 結(jié)果  克隆了hera基因，測(cè)序正確;利用pRSET-C載體在大腸桿菌中融合表達(dá)了全長(zhǎng)hera-cDNA基因，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的59.6%.融合蛋白在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在，在變性條件下用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白，其純度達(dá)到了98.0%. 結(jié)論  利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌中高表達(dá)了hera基因.并對(duì)融合蛋白進(jìn)行了初步純化.  

3、0;  Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation     Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRS

4、ET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）andinduced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be correct.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed i

5、n E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CONCLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli b

6、y using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily.     0 引言     era基因是1986年在測(cè)定大腸桿菌基因組序列時(shí)，在編碼RNaseIII的rnc基因下游發(fā)現(xiàn)的一個(gè)開(kāi)放讀框，因其編碼的氨基酸序列與人及酵母的Ras蛋白有部分相似之處，命名為E.coli Ras-like（era）基因1 .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕蟲、小鼠、人、植物中也存在與細(xì)菌era高度同源的基因.Era蛋

7、白是小G蛋白家族的新成員.它由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:N端是一個(gè)典型的GTPase結(jié)構(gòu)域;C端結(jié)構(gòu)域?yàn)镋ra所特有，其中含有一個(gè)KH結(jié)構(gòu)域2 .在大腸桿菌中era基因和rnc基因同屬于rnc操縱元，rnc基因和era基因的表達(dá)共同受RNaseIII的負(fù)調(diào)控3 .era是大腸桿菌中可以正常表達(dá)的基因，但表達(dá)水平極低.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)era基因與細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂有關(guān)，是細(xì)菌生存繁殖所必需的重要基因 4 .高表達(dá)的細(xì)菌Era蛋白有GTP結(jié)合及GTPase活性5 .最近發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Era蛋白可以特異地與16S-rRNA結(jié)合6 .    本室陳蘇民教授通過(guò)計(jì)算機(jī)尋索，發(fā)現(xiàn)從線蟲、小鼠到

8、人都有與細(xì)菌era同源的EST序列，并且相繼克隆了人及小鼠全長(zhǎng)的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全長(zhǎng)約2.2kb，含長(zhǎng)度為1038bp的開(kāi)放讀框，編碼346氨基酸的蛋白質(zhì)7 .人Era（hEra）與大腸桿菌Era（eEra）蛋白全序列比較，有31.0%相同、53.0%相似.同樣，hEra也是由N端的GTPase結(jié)構(gòu)域和C端KH結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成8 .新近克隆的人及小鼠era基因?yàn)檎麄€(gè)era基因家族的功能研究提供了重要的資料.本研究目的是將hera基因在大腸桿菌中進(jìn)行高表達(dá)、純化.這為進(jìn)一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基礎(chǔ).     1 材料和

9、方法     1.1 材料  大腸桿菌BL21（DE3）菌種購(gòu)自Promega公司.pUC19質(zhì)粒均為本教研室保存;表達(dá)質(zhì)粒pRSET-C為Invitrogen公司產(chǎn)品.pBS-hera為陳蘇民教授提供.各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸修飾酶及Taq酶均為Gibco公司產(chǎn)品.DNA marker和蛋白marker為Takara公司產(chǎn)品.柱式質(zhì)粒純化試劑盒為華舜公司產(chǎn)品.NucleoTrap Gel Extraction試劑盒購(gòu)于CLONTECH公司.Ni-NTA spin kit為QIAGEN公司產(chǎn)品. 1.2 方法  

10、60; 1.2.1 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物的鑒定  PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向:5'-AA-CTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC.PCR反應(yīng)以pBS-hera為模板在PE公司9600反應(yīng)儀上進(jìn)行.PCR反應(yīng)條件為:9630s，5545s，7260s，30個(gè)循環(huán).純化的PCR產(chǎn)物用BamHI和PstI雙酶切定向克隆入pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，進(jìn)行藍(lán)白篩選，并經(jīng)酶切鑒定篩選出含插入片段的陽(yáng)性克隆.重組的pUC19質(zhì)粒經(jīng)提取純化后，以此作為測(cè)序模板，在PE公司310型測(cè)序儀上進(jìn)行核苷酸序列分析.

11、     1.2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建  從重組的pUC19質(zhì)粒上用BamHI和PstI切下目的片段，再用BamHI和PstI雙酶切pRSET-C載體.目的片段與載體片段均用NucleoTrap Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠內(nèi)回收.然后進(jìn)行DNA的連接，將DNA連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐抗性進(jìn)行篩選，經(jīng)酶切鑒定出含插入片段的陽(yáng)性克隆.     1.2.3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)  挑取pRSETC-hera重組表達(dá)菌株，接種于5mL含Amp的2xYT培養(yǎng)基（胰

12、蛋白胨16g L-1 ，酵母提取物10g L-1 ，NaCl5g L-1 ），37培養(yǎng)過(guò)夜，次日按4.0%轉(zhuǎn)接于含Amp的2xYT培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)3h，加入IPTG至終濃度1mmol L-1 誘導(dǎo)表達(dá)，37振蕩培養(yǎng)27h.取菌體，做120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）.    1.2.4 SDS-PAGE 49000g離心5min收集菌體，用含3mL L -1 巰基乙醇加樣緩沖液處理（100， 10min），12000g離心10min，采用Laemmli不連續(xù)PAGE，150g L-1 分離膠，考馬斯亮藍(lán)R-250染色. 1.2.5

13、 蛋白質(zhì)的純化  離心收集100mL誘導(dǎo)菌液的菌體，按每克濕菌體10mL加入超聲緩沖液（0.05mol L-1 NaH2 PO4 ，0.3mol L-1 NaCl）懸浮，-20凍融2次，再加入溶菌酶至1g L-1 ，室溫放置30min，然后超聲裂解（150W，每次1min，共5次），4下12000g離心20min.再加入超聲緩沖液10mL懸浮包涵體，4下12000g離心20min，收集包涵體沉淀.用5mL緩沖液B（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris Cl，pH8.0）懸浮包涵體，Vortex，室溫放置2h，4下12000g離心15min，取上清，4下12000g再離心15min，留上清上Ni-NTA親和色譜柱.先用緩沖液B預(yù)平衡Ni-NTA柱，上樣，用緩沖液C（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH6.3