肝癌靶向性AGAP表達(dá)載體構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

1、肝癌靶向性AGAP表達(dá)載體構(gòu)建及生物信息學(xué)分析 作者：金思思，吳金明，黃智銘，吳建勝，申蘇建【摘要】 目的?：構(gòu)建肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)特異性鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(analgesic-antitumor peptide，AGAP)基因真核表達(dá)載體，利用計(jì)算機(jī)輔助分析和預(yù)測(cè)所表達(dá)蛋白質(zhì)的理化和結(jié)構(gòu)特征，為探索生物毒素靶向抗肝癌作用奠定基礎(chǔ)。方法：提取東亞鉗蝎總RNA，用RT-PCR法擴(kuò)增出AGAP基因，與載體pGL3/AFP連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，酶切及測(cè)序鑒定，并利用蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)其表達(dá)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)水平及一些生物學(xué)特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞檢測(cè)其是否

2、表達(dá)。結(jié)果：重組質(zhì)粒所表達(dá)的目的多肽經(jīng)軟件分析，發(fā)現(xiàn)在二級(jí)結(jié)構(gòu)上沒有變化，親水性、抗原性等生物學(xué)活性也未受影響，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后能成功表達(dá)。結(jié)論：人AFP基因順式作用元件調(diào)控AGAP真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 【關(guān)鍵詞】 甲胎蛋白;鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽;真核表達(dá)載體;肝腫瘤Abstract: ? Objective: To construct a gene-modified hepatocellular carcinoma?(HCC)?specific AGAP expression vector regulated by the cis-acting element of AFP. The phys

3、icochemical property and structural characteristics of the protein were analyzed and predicted by computer-aided analysis to establish a basis for exploring biotoxin thepapy for tumor. Method:?The AGAP DNA fragment was amplified through RT-PCR from the total RNA of Chinese Buthus Martensii Karsch. I

4、t was then cloned into the plasmid pGL3/AFP. The recombinant plasmid pAFP-AGAP was identified by restriction endonucleases and nucleotide sequence. The protein analysis software were utilized to predict the flexibility，hydrophilicity，and antigenicity of the new AGAP protein. Then the expression leve

5、ls of AGAP mRNA were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction?(RT-PCR)?after the recombinant plasmid being transfected into HepG2 cell line. Results:?Through the analysis of the software，?it could be found that the secondary structure of the new AGAP didnt almost changed and remai

6、n their biologic activity. The recombinant plasmid was successfully to express AGAP mRNA in HepG2 cell line. Conclusion:?The recombinant vector is constructed successfully.Key words: ?alpha fetoprotein;analgesic-antitumor peptide;eukaryotic expression vector; hepatocellular carcinoma肝細(xì)胞癌(hepatocellu

7、lar carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，是我國(guó)癌癥患者病死率最高的疾病之一。手術(shù)、放化療及介入等常規(guī)治療效果均不理想，不能從根本上改善患者的預(yù)后。目前，利用基因工程的手段，實(shí)現(xiàn)AFP轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)，對(duì)肝癌進(jìn)行基因治療，是肝癌治療的熱點(diǎn)1。另外，蝎毒是一種毒性僅次于蛇毒的生物毒素，早在宋代全蝎就被用于治療驚厥、癲癇及腫瘤等疾病。很多人試圖從蝎毒中提取有抗腫瘤活性的組分，開發(fā)有效的、相對(duì)毒副作用較小的新藥。近年來，東亞鉗蝎毒(Buthus martensii Karsch)的藥用研究是我國(guó)生物毒素方面研究和開發(fā)的熱點(diǎn)之一。東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤肽(Analgesi

8、c-antitumor peptide，AGAP)就是從東亞鉗蝎毒中分離出的一種有效的抗腫瘤成分，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，并對(duì)動(dòng)物移植癌有抑制作用2-3。本實(shí)驗(yàn)利用基因工程手段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)AGAP細(xì)胞內(nèi)直接表達(dá)，省去了蝎毒分離、純化等繁瑣步驟，為進(jìn)一步研究其在肝癌基因治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。1?材料和方法1.1?材料?攜帶有效AFP啟動(dòng)子和增強(qiáng)子組合的質(zhì)粒pGL3/AFP由Cheng Qian(Fundacin para la Investigacin Mdica Aplicada)構(gòu)建饋贈(zèng)。菌株DH5和人肝癌細(xì)胞(HepG2)由本室凍存。RNA提取試劑(RNAiso Reagen

9、t)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BCa BESTTM RNA PCR Kit Ver 1.1)購自大連寶生物公司，各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，質(zhì)粒提取試劑盒(EZ Spin Col-umn Plasmid DNA Minipreps Kit)購自BBI公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自TIANGEN公司，DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司，胰酶購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，LipofectamineTM 2000購自美國(guó)Invitrogen公司。1.2?引物設(shè)計(jì)?根據(jù)GeneBank中AGAP(AF464898)能表達(dá)66個(gè)成熟肽的基因序列及pGL

10、3/AFP序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。AGAP基因上游引物順序?yàn)椋?- CATGCC ATGGCCGTACGCGATGGTTATATTGCCG -3，引入了Nco I酶切位點(diǎn)，下游引物順序?yàn)椋?- TGCTCTAGAGACCG CCATTGCATTTTCCTG -3，引入了Xba?I酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)已含起始密碼和終止密碼。1.3?AGAP基因克隆?取新鮮的蝎尾，抽提RNA，按試劑盒步驟操作。利用RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA第1鏈，引物采用Oligo dT，條件為：65 1 min、30 5 min、65 20 min、98 5 min、5 5 min。采用高保真Taq酶進(jìn)行隨后的PCR反應(yīng)。PCR條件為

11、：94 預(yù)變性5 min，94 30 s、54 30 s、72 1 min，28個(gè)循環(huán)，末次72 延伸5 min。取PCR產(chǎn)物電泳，后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收待用。1.4?pAFP-AGAP真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定?取質(zhì)粒pGL3/AFP用Nco?I和Xba?I雙酶切，將所需載體片段4?188 bp經(jīng)電泳分離出并回收。膠回收的AGAP基因片段經(jīng)Nco?I和Xba?I雙酶切，獲目的基因201 bp與所需載體片段4?188 bp按3:1的比例混合，加入T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，16 過夜。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，擴(kuò)增后質(zhì)粒提取試劑盒提取。新構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pAFP-AGAP(見

12、圖1)酶切鑒定并測(cè)序。雙向測(cè)序由華大基因完成。1.5?生物信息學(xué)分析?DNA測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pAFP-AGAP的方向性和正確性，雙向序列測(cè)定由華大基因公司完成，測(cè)序結(jié)果使用Gene bank Blast進(jìn)行比對(duì);采用Vector NTI軟件對(duì)pAFP-AGAP序列進(jìn)行讀框(ORF)分析，然后用Translation程序推導(dǎo)并輸出氨基酸序列;應(yīng)用網(wǎng)站提供的ProtParam方案以及DNAStar軟件中的Protean程序進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析。1.6?重組質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)?HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素DMEM培

13、養(yǎng)液中，37 ，體積分?jǐn)?shù)5 %CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，用新鮮無抗性培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1105/mL，以每孔2 mL接種于6孔板培養(yǎng)過夜。次日將質(zhì)粒pAFP/AGAP與脂質(zhì)體(g/L)以1:3比例混合后轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，按LipofectamineTM 2000說明書操作。轉(zhuǎn)染后24 h，Trizol提取每孔細(xì)胞的RNA。RT-PCR 法檢測(cè)AGAP mRNA表達(dá)(條件同上)，其擴(kuò)增產(chǎn)物電泳并測(cè)序鑒定。雙向測(cè)序由華大基因完成。2?結(jié)果2.1?AGAP基因克隆?提取的總RNA A260/A280比值為1.82，表明總RNA較純。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得

14、特異性條帶208 bp與預(yù)期長(zhǎng)度相符(見圖2)。2.2?重組質(zhì)粒酶切鑒定?重組質(zhì)粒pAFP-AGAP經(jīng)Nco?I和Xba?I雙酶切為201 bp和4?149 bp兩片段，Xba?I單酶切符合4?395 bp大小，還用Kpn?I和Xba?I雙酶切pAFP-AGAP便于觀察，得3?081 bp和1?308 bp兩個(gè)片段(見圖2)。2.3?生物信息學(xué)分析?pAFP-AGAP經(jīng)雙向測(cè)序結(jié)果證實(shí)融合基因插入方向正確，經(jīng)Gene bank Blast比對(duì)，有98%的堿基與GenBank序列相同，部分不同可能由基因突變或者基因克隆過程中錯(cuò)配引起。結(jié)果顯示AGAP基因序列與原設(shè)計(jì)相符。重組質(zhì)粒Vector NTI讀框分析表明，含AFP順式作用元件的真核表達(dá)載體pAFP-AGAP下游插入了完整的目的基因AGAP，起始密碼ATG，終止密碼TAG，編碼68個(gè)氨基酸。ProtParam分析顯示，該AGAP蛋白分子量：16?355.9 Da，等電點(diǎn)：5.36，分子式： C606H1010N204O257S34，半衰期： 30 h(哺乳動(dòng)物)，不穩(wěn)定系數(shù): 20.97，該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白。DNAStar軟件中的Protean程