MidkinemRNA在食管鱗癌患者外周血中的表達及其臨床意義

1、Midkine mRNA在食管鱗癌患者外周血中的表達及其臨床意義                                          作者：胡俊,田小強,商延芳,劉飛,劉全俊,

2、黃培林【摘要】  目的:探討靶基因中期因子(MK)在食管鱗癌患者外周血中的表達及其與食管鱗癌生物學行為的關系。方法:采用巢式RTPCR方法檢測54例食管鱗癌患者外周血的MK mRNA。10例正常健康志愿者外周血為陰性對照，11例食管鱗癌腫瘤組織為陽性對照。結果:54例食管鱗癌患者外周血MK mRNA陽性率為61.11%(33/54)，并與食管鱗癌患者淋巴結轉移有顯著相關性(P<0.05)，而健康成人外周血則無一例出現陽性。結論:應用巢式RTPCR方法檢測食管癌患者外周血中的MK mRNA具有較高的敏感性和特異性，它有望成為判斷食管鱗癌惡性程度、轉移、復發(fā)和監(jiān)測療效的客觀指標。

3、【關鍵詞】  中期因子;食管鱗癌;外周血;腫瘤標志物;生物學行為研究表明，惡性腫瘤在侵襲和轉移的早期階段就有癌細胞入血，即微轉移（micrometastasis），它是腫瘤的惡性標志和主要特征之一，也是導致治療失敗和患者死亡的主要原因之一。因此，早期診斷腫瘤微轉移是提高惡性腫瘤治療效果、改善患者預后的有效途徑之一12。而巢式RTPCR可在1×107個單個核細胞中檢出110個腫瘤細胞，其敏感性、特異性遠高于其他方法3。迄今為止，國內外尚未見食管鱗癌患者外周血中期因子(midkine，MK)mRNA表達情況的研究報道。本研究擬用巢式RTPCR方法檢測食管鱗癌患者外周血的MK m

4、RNA表達，并探討其與食管鱗癌生物學行為的關系。1  材料與方法1.1  材料1.1.1  樣本  54例食管鱗癌患者均為東南大學附屬中大醫(yī)院胸外科20042006年的住院患者，所有病例均經病理確診；男40例，女14例；年齡4683歲，平均63.4歲。取術前患者外周血3ml。以11例食管鱗癌腫瘤組織標本為陽性對照，10例健康志愿者外周血為陰性對照。1.1.2  試劑  淋巴細胞分離液和DEPC為南京生興生物技術有限公司產品，Trizol試劑、RTPCR試劑盒及Taq酶等為日本TaKaRa公司產品。1.1.3  引物 

5、; 參照有關文獻，采用Primer5引物設計軟件自行設計，所有引物均由江蘇百龍基因有限公司合成。引物序列見表1。表1  actin和MK基因的引物序列（略）Tab1  Primer sequences of actin and MK1.2  方法1.2.1  樣本處理及總RNA提取  抽取術前患者外周靜脈血3ml，以枸櫞酸鈉抗凝，用淋巴細胞分離液按密度梯度離心法常規(guī)分離單個核細胞。腫瘤組織以勻漿器研碎得細胞懸液。Trizol一步法分別提取總RNA20l，將提取的RNA于紫外分光光度計上定量，并行10%瓊脂糖凝膠電泳，以明確RNA未降解。1.2.

6、2  逆轉錄合成cDNA和PCR擴增  所有標本各取5l RNA，706min變性，根據TaKaRaRNA試劑盒進行cDNA第1鏈合成，行MK巢式PCR。第1輪PCR：取cDNA5.0l，10×PCRbuffer2.5l，25mmol·L1MgCl20.5l，10mmol·L1dNTP0.5l，10pmol·L1第1輪PCR上、下游引物各2.5l，TaqDNA聚合酶1.25U，加滅菌水至25l。反應條件：945min預變性；9430s，6030s，7260s，30個循環(huán)；725min延伸。第2輪PCR：取第1輪PCR產物2.0l作模板

7、，加10pmol·L1第2輪PCR上、下游引物各2.5l，除退火溫度改為53外，余反應體系及反應條件同前。選擇actin基因作為內參照質控指標。PCR反應中加入其上、下游引物各2.5l，擴增條件除退火溫度改為56外，余反應體系及反應條件同前，但只進行1輪擴增。1.2.3  RTPCR產物鑒定  將第1輪PCR產物雙向測序，并取第2輪MK PCR產物及actinPCR產物各5l加樣于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓80V，電泳約25min，然后用紫外光凝膠成像系統(tǒng)掃描并拍照。在相應位置(531、272bp)出現肉眼可見條帶判為陽性(圖1)。MK產物帶272 bp，a

8、ctin產物帶531bpM.Marker；1.腫瘤組織陽性對照；2.健康捐獻者外周血陰性對照；37.患者外周血圖1  3種標本PCR產物瓊脂糖凝膠電泳示例（略）Fig 1  Example of three kines of PCR products separated by gel electrophoresis1.3  統(tǒng)計學處理用SPSS軟件分析各組數據，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。               

9、;              2  結果2.1  MK mRNA測序結果PCR產物采用上、下游引物進行雙向測序，結果如下：5ATGCAGCACCGAGGCTTCCTCCTCCTCACCCTC CTCGCCCTGCTGGCGCTCACCTCCGCGGTCGCCAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCCGGGGAGCGAGTGCGCTGAGTGGGCCTGGGGGCCCTGCACCCCCAGCAGCAAGGATTGCG

10、GCGTGGGTTTCCGCGAGGGCACCTGCGGGGCCCAGACCCAGCGCATCCGGTGCAGGGTGCCCTGCAACTGGAAGAAGGAGTTTGGAGCCGACTGCAAGTACAAGTTTGAGAACTGGGGTGCGTGTGATGGGGGCACAGGCACCAAAGTCCGCCAAGGCACCCTGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCAGTGCCAGGAGACCATCCGCGTCACCAAGCCCTGCACCCCCAAGACCAAAGCAAAGGCCAAAGCCAAGAAAGGGAAGGGAAAGGACTAGACGCCAAGCCTGGAT3。應用美國國家生物

11、技術信息中心（NCBI）中的BLAST分析軟件，將第1輪PCR產物測序結果與從GenBank數據庫獲取這種MK基因的mRNA全長序列比對，結果完全一致。圖2為部分測序結果。2.2  食管鱗癌患者外周血中MK mRNA表達54例食管鱗癌患者外周血中MK mRNA的陽性率為61.11%(33/54)。陽性對照組11例食管鱗癌組織中MK mRNA表達率為81.82%（9/11)；陰性對照組10例健康志愿者外周血MK mRNA則全部陰性表達。圖2  MK測序圖（略）Fig 2  Sequence map of MK2.3  食管鱗癌患者外周血中MK mRNA表達

12、與臨床病理的相關性分析本實驗將患者按性別、年齡、細胞分化、臨床分期、有無淋巴結轉移、浸潤深度及有無遠處轉移進行分類列表，探討MK基因表達改變。根據年齡分為60歲和>60歲兩組；按病理形態(tài)將腫瘤分化程度分為高(分化良好)、中(分化中等)、低(低、未分化)3大類；臨床分期根據美國癌癥分期聯合委員會(AJCC)的腫瘤分期法，即根據腫瘤波及的范圍(原位、器官內、器官外、侵入鄰近器官、遠處轉移)分為5期(0期)，按0期和期兩組討論；浸潤深度按傳統(tǒng)TNM分期法分為T1T2和T3T4兩欄進行比較。結果見表2。MK mRNA表達在有無淋巴結轉移組之間存在差異(P<0.05)，而其它各組無明顯差異(

13、P>0.05)，提示食管鱗癌患者外周血中MK mRNA陽性表達與患者的性別、年齡、臨床分期、細胞分化程度無明顯相關，而與患者有無淋巴結轉移有關。另外4例食管鱗癌術后復發(fā)患者和1例遠處轉移患者外周血中MK基因均為陽性（100%，5/5)。表2  食管鱗癌患者外周血中MK mRNA表達情況與病理分型、分期的關系（略）Tab 2   Relationship between expression of MK mRNA and pathologic type and stage of tumor1）P<0.053  討論MK作為肝素結合生長因子家族的

14、一員，是一種能被維甲酸誘導產生的生長因子，具有促神經軸突生長、組織修復和促進血管生長等作用。正常生理情況下，MK基因表達具有時間性和空間性的特征，并隨個體的發(fā)育而變化，在胚胎期高表達，出生后逐漸降低，在成年組織中，除腎臟和小腸上皮外其它部位幾乎不表達45。而不斷有研究表明，MK在人類多種癌組織中出現高頻率、高強度表達。到目前為止，仍不斷有表達MK的新腫瘤病例的報道56。特別在嬰幼兒最多見的惡性腫瘤之一Wilms腫瘤中，Adachi等7發(fā)現人MK基因啟動子-157-149區(qū)域有Wilms腫瘤抑制基因WT1的結合位點，正常情況下WT1與其結合，抑制MK基因表達，當WT1缺失，抑制作用被解除，這也是

15、幾乎所有Wilms腫瘤中均可見MK過表達的原因。在食管癌方面，王瓊等8采用免疫組織化學染色方法檢測的45例食管癌中，35例為陽性，表達率高達778%，并與腫瘤血管形成有關。本實驗陽性對照組11例食管鱗癌腫瘤組織中9例MK mRNA表達陽性(8182%)的結果與之一致。Shimada等9還在檢測血清中MK蛋白的濃度時發(fā)現，61%的食管鱗癌患者MK蛋白濃度明顯升高，且與腫瘤的大小及預后相關。這些研究都說明，MK可能參與腫瘤形成，并有望成為一種新的腫瘤標志物。本研究應用巢式RTPCR方法檢測54例食管鱗癌患者外周血的MK mRNA表達情況，其陽性率為61.11%(33/54)。將實驗結果與食管鱗癌患

16、者臨床病理資料綜合分析發(fā)現，MK基因的表達在有無淋巴結轉移之間有顯著差異(P<0.05)，提示食管鱗癌患者外周血中MK mRNA的表達可反映該腫瘤細胞具有較強的惡性生物學行為。另外，雖然本研究中收集食管鱗癌手術復發(fā)患者和遠處轉移患者外周血標本較少(5例)，但MK mRNA均為陽性(5/5)，而作為陰性對照的10例志愿者外周血MK mRNA均陰性表達。結果顯示，食管鱗癌患者外周血中MK mRNA陽性表達可提示腫瘤細胞具有較強的侵襲甚至轉移的能力。目前，對MK基因的研究還處于初級階段，它最終的生理和病理作用還未完全清楚。本研究結果提示，食管鱗癌患者外周血中MK mRNA的表達有望成為判斷食管

17、鱗癌生物學行為惡性程度、轉移、復發(fā)和監(jiān)測療效的客觀指標，但在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制尚需進一步探討?！緟⒖嘉墨I】  1WANG J Y，WU C H，LU C Y，et al. Molecular detection of circulating tumor cells in the peripheral blood of patients with colorectal cancer using RTPCR: significance of the prediction of postoperative metastasisJ.World J Surg，2006，30(6):1

18、0071013.2HUANG P，WANG J，GUO Y，et al.Molecular detection of disseminated tumor cells in the peripheral blood in patients with gastrointestinal cancerJ.J Cancer Res Clin Oncol,2003,129(3):192198.3PECK K，SHER Y P，SHIN J Y，et al.Detection and quantization of circulating cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patientsJ.Cancer Res,1998,58:27612765.4KITAMURA M，SHIRASAWA T，MITARAI T，et al.A retinoid responsive cytokine gene MK is preferentially expressed in the proximal tubules of the ki