BioEdit及MEGA分析序列同源性簡(jiǎn)介

1、利用系統(tǒng)進(jìn)化分析軟件對(duì)序列進(jìn)行同源性分析1.0 目的1.1 為了保持國(guó)際上各個(gè)耐藥性實(shí)驗(yàn)室的高檢驗(yàn)水準(zhǔn)，進(jìn)行分子進(jìn)化分析是有很重要作用的。它不僅可以保證流行病學(xué)目的順利實(shí)現(xiàn)，而且有利于發(fā)現(xiàn)檢測(cè)階段可能產(chǎn)生的潛在的交叉污染。1.2 利用此軟件進(jìn)行分析所得的信息對(duì)于進(jìn)行艾滋病毒在人群中傳播的流行病學(xué)研究具有十分重要的意義。1.3 通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室之前分析的數(shù)據(jù)與當(dāng)前數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)在此前實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由于標(biāo)本處理不當(dāng)所導(dǎo)致的潛在的實(shí)驗(yàn)室污染。1.4 對(duì)于確保得到高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并及時(shí)發(fā)現(xiàn)可能出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里的問(wèn)題具有重要意義。 2.0 儀器設(shè)備2.1 計(jì)算機(jī)一臺(tái)。2.2 Windows 95以上的操作

2、系統(tǒng)。2.3 BioEdit 以及 MEGA 4 分析軟件。2.3.1 均為免費(fèi)軟件，可以從互聯(lián)網(wǎng)上下載，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行安裝。3.0 操作過(guò)程3.1 局限及要求3.1.1 經(jīng)過(guò)序列編輯軟件拼接處理后的txt文件或fasta文件均可，例如ChromasPro軟件。3.1.2 可以在MEGA上分析的分子序列或距離矩陣數(shù)據(jù)。3.1.3 Mega 4軟件只能將長(zhǎng)度相等的序列轉(zhuǎn)換為MEGA輸出文件，因此，任何多序列文件必須通過(guò)BioEdit軟件進(jìn)行對(duì)齊修剪，然后才能進(jìn)入通過(guò)Mega軟件轉(zhuǎn)換成*.meg格式進(jìn)行分析。3.1.4 該數(shù)據(jù)集的大小受限于計(jì)算機(jī)上可用的物理（RAM）和虛擬內(nèi)存。3.1.5 分析的

3、序列必須包括兩個(gè)或兩個(gè)以上長(zhǎng)度相同的序列，所有序列分析之前必須用MEGA軟件對(duì)齊。3.1.6 核苷酸和氨基酸序列應(yīng)該用英文字母連續(xù)書寫，不區(qū)分大小寫。一些特殊的特殊符號(hào)，例如表示對(duì)齊缺口，堿基缺失等的符號(hào)也可以包含在序列中。3.1.7 空格和制表符經(jīng)常用于數(shù)據(jù)文件中，因此會(huì)被MEGA忽略。 ASCII字符，如（.）（ - ）（？），一般都作為特殊符號(hào)來(lái)表示序列中的不同堿基，分別表示第一個(gè)序列，對(duì)齊缺口及堿基缺失。3.1.8 BioEdit 軟件進(jìn)行序列比對(duì)3.1.9 雙擊BioEdit 圖標(biāo) 打開(kāi)BioEdit 序列對(duì)比編輯器窗口。3.1.10 從工具欄上，單擊new alignment圖標(biāo)打

4、開(kāi)一個(gè)新窗口。3.1.11 點(diǎn)擊 File 菜單, 選擇 import and sequence alignment file3.1.12 出現(xiàn)一個(gè)新窗口, 選擇要導(dǎo)入的文件存儲(chǔ)地址及文件名, 點(diǎn)擊 open. 所有需要的序列都會(huì)在導(dǎo)入窗口中呈現(xiàn)。3.1.13 點(diǎn)擊Edit 并選擇 Select All Sequences，現(xiàn)在可以準(zhǔn)備對(duì)所有的序列進(jìn)行比對(duì)。3.1.14 點(diǎn)擊 Accessory Application 并選擇ClustalW Multiple alignment ，打開(kāi)一個(gè)新窗口。3.1.15 點(diǎn)擊窗口下方的 Run ClustalW ，將打開(kāi)一個(gè)新窗口，點(diǎn)擊下方的OK.3.

5、1.16 序列比對(duì)將進(jìn)行，進(jìn)行的時(shí)間取決于所要比對(duì)的序列的長(zhǎng)度及數(shù)量。3.1.17 比對(duì)結(jié)束后，經(jīng)過(guò)比對(duì)的序列將呈現(xiàn)在一個(gè)新窗口中。3.1.18 將模式（Mode）欄中改為edit，即可對(duì)序列進(jìn)行剪切，使其長(zhǎng)度一致。3.2 比對(duì)及編輯結(jié)束后，點(diǎn)擊File 并選擇 Save 保存比對(duì)后的文件. 3.3 用MEGA軟件分析進(jìn)行距離和系統(tǒng)進(jìn)化分析3.3.1 雙擊MEGA4 圖標(biāo)打開(kāi) MEGA4.3.3.2 序列比對(duì)格式轉(zhuǎn)換:3.3.2.1 從 File 菜單中, 選擇 Convert To Mega Format, 打開(kāi) Text File Editor and Format Converter 窗

6、口。3.3.2.2 選擇屏幕中間的File and Format 對(duì)話框。3.3.2.3 選擇要導(dǎo)入的文件存儲(chǔ)地址及文件名， 點(diǎn)擊OK，在Text File Editor and Format Converter窗口中出現(xiàn)mega 格式的文件。3.3.2.4 保存文件，關(guān)掉此頁(yè)面返回MEGA4.主界面。3.3.3 打開(kāi) mega 文件3.3.3.1 從File 菜單中打開(kāi) mega文件, 選擇 open data, 或從窗口中打開(kāi) Click me to active a data file.3.3.3.2 打開(kāi)文件后, Input Data 對(duì)話框?qū)⒊霈F(xiàn). 在左側(cè)一欄選擇Nucleotide

7、 Sequences,默認(rèn)右側(cè)當(dāng)前選擇，點(diǎn)擊OK.3.3.3.3 出現(xiàn)一個(gè) Confirm 對(duì)話框, 點(diǎn)擊Yes.3.3.3.4 Select Genetic Code box opens被打開(kāi),通常默認(rèn)所有選項(xiàng)，點(diǎn)擊OK .3.3.3.5 文件名及信息將會(huì)出現(xiàn)在窗口下方。3.3.4 打開(kāi)Mega文件后3.3.4.1 File 菜單中, 進(jìn)行編輯, 導(dǎo)出或轉(zhuǎn)換文件。3.3.5 Data 菜單中, 可以用不同形式瀏覽文件，例如轉(zhuǎn)換成氨基酸形式。3.3.6 距離分析3.3.6.1 Distances 菜單中, 選擇Compute Pairwise. 出現(xiàn)Analysis Preferences 窗

8、口。3.3.6.2 在Distance options 列表中, 選擇 Nucleotide: Kimura 2-parameter for Models, 選擇 Distances only for Comput, 并選擇d: Transitions + transversions for Substitutions to include. 3.3.6.3 Include Sites list, 選擇 Complete Deletion for Handling Gap/Missing Data, 選擇 1st, 2nd, 3rd for Codon Positions/Sites Incl

9、uded, 點(diǎn)擊 OK. 3.3.6.4 Pairwise Distances 窗口打開(kāi)，在文件中將顯示每?jī)蓚€(gè)序列距離的矩陣。3.3.7 File 菜單中, 選擇Export/Print Distances, 在Text File Editor and Format Converter 窗口中將出現(xiàn)一個(gè)名為 Distances 的文件，它顯示了所有的信息及距離矩陣，保存后可以用記事本或?qū)懽职宕蜷_(kāi)。3.3.8 進(jìn)化分析3.3.8.1 Phylogeny菜單中，選擇Neibour-Joining(NJ), Analysis Preferences 框?qū)⒋蜷_(kāi)。3.3.8.2 在Distance op

10、tions 列表中, 選擇Nucleotide: Kimura 2-parameter for Models, 選擇 Distances only for Comput, 選擇d: Transitions + transversions for Substitutions to include. 3.3.8.3 Include Sites list, 選擇 Complete Deletion for Handling Gap/Missing Data, 選擇1st, 2nd, 3rd for Codon Positions/Sites Included. 3.3.8.4 在Test of Ph

11、ylogeny 列表中, 選擇Bootstrap for Test of Inferred Phylogeny. 3.3.8.5 屏幕的右側(cè)將出現(xiàn)一個(gè)小對(duì)話框，選擇1000 for Replications, 然后點(diǎn)擊OK, 進(jìn)程框?qū)⒋蜷_(kāi)。3.3.8.6 進(jìn)程結(jié)束后, Tree Explorer 窗口將顯示兩種進(jìn)化樹(shù) 。同源樹(shù)Original tree 是我們所需要的。3.3.8.7 File菜單中, you can save the tree data as可以將所做的樹(shù)通過(guò)Save鍵保存成Tree Session File(*.mts), 或者選擇Export Current Tree得到 Tree Data File(*.tre)文件, 兩種格式的文件都能被MEGA或其他軟件所識(shí)別。3.3.8.8 Image 菜單中, 選擇Copy to Clipboard, 進(jìn)化樹(shù)即可被復(fù)制并粘貼到word文檔或ppt文檔中進(jìn)一部編輯。3.3.9 交叉污染的判斷:3.3.9.1 如果有兩個(gè)或者更多的序列在進(jìn)化樹(shù)中距離非常接近或者兩個(gè)分支有相同的結(jié)點(diǎn)且有相同的水平距離，而序列之間又沒(méi)什么流行病學(xué)聯(lián)系, 那么這些標(biāo)本則需要從核酸提取階段進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，以此驗(yàn)證它們之間的相近關(guān)系并排除交叉污染。 3.4 亞型的初步分析:3.4.1 用NCBI 基因分型工具進(jìn)行亞型的初步分析