終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組二維電泳圖像與正常血清蛋白圖譜比較

1、終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組二維電泳圖像與正常血清蛋白圖譜比較研究王劍青1,戴勇2,鄧安國1,劉建軍3(11華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科,湖北武漢430022;21廣東省深圳市人民醫(yī)院31廣東省深圳市疾病預防控制中心【摘要】目的建立和優(yōu)化終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳及相關(guān)技術(shù),并與正常血清蛋白圖譜比較。方法以固相pH梯度等電聚焦為第一向和垂直S DS2聚丙烯酰胺凝膠電泳為第二向,對終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)樣品制備、上樣量、I PG膠條、等電聚焦等進行條件優(yōu)化。質(zhì)譜鑒定有差異表達的其中4個蛋白點。結(jié)果成功獲得終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組電泳圖譜,與正常者相比存在表達有明顯差異

2、的蛋白點。結(jié)論成功建立了終末期腎病患者血清蛋白質(zhì)組研究的雙向電泳技術(shù)平臺。關(guān)鍵詞腎功能衰竭;蛋白質(zhì)組;電泳,凝膠,雙向Est ablish m en t of two2d i m en si ona l gel electrophoresis techn i ca l pl a tfor m for the blood seru m proteo m e research i n pa ti en ts w ith end st age rena l d isea seWAN G J ian2qing,DA I Yong,D eng A n2guo,L I U J ian2jun.Depart

3、 m ent of Nephr ol ogy,Uni on Hos p ital,TongjiM edical College,Huazhong University of Science and Technol ogy,W uhan430022,China【Abstract】O bjecti veTo establish and op ti m ize the t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis technical p latf or m f or the bl ood seru m p r o2 teome research in patie

4、nts with end stage renal disease(ESRD.M ethodsI m mobiline pH gradients is oelectric focusing was used as the first di m ensi onal gel electr ophoresis and the vertical S DS2P AGE was used as the second di m ensi onal gel electr ophoresis(22DE.The4dif2 ferentially exp ressed p r otein s pots were id

5、entified by mass s pectr ometry.ResultsSatisfact ory22DE map s of ESRD patients seru m p r otein were obtained and there were s ome differentially p r otein s pots bet w een the22DE map s of ES RD patients and nor mal contr ols.Conclusi on sThe22DE technol ogy for the seru m p r oteome of ESRD patie

6、nts is set up.【Key words】Kidney failure;Pr oteome;Electr ophoresis,gel,t ow di m ensi onal自從發(fā)現(xiàn)22MG 參與透析相關(guān)淀粉樣變后,提示蛋白質(zhì)可成為一類特殊的尿毒癥毒素1?，F(xiàn)已分離和鑒定出的蛋白質(zhì)毒素有數(shù)十種,但終末期腎病(ESRD患者癥狀及并發(fā)癥復雜,僅用數(shù)十種蛋白和其它一些中分子及小分子毒素并不能完全解釋。若能將ESRD 患者和正常人的血清蛋白質(zhì)譜比較,將為今后對那些異常表達的蛋白進行分離、鑒定和體內(nèi)外實驗,最終判定是否為尿毒癥蛋白質(zhì)毒素提供一個早期實驗基礎(chǔ)。但血液蛋白質(zhì)成分復雜,含有多種鹽、脂質(zhì)等影

7、響蛋白質(zhì)分離的物質(zhì)2,因此建立一個優(yōu)化的血液蛋白質(zhì)組研究技術(shù)體系非常重要。為獲得準確性和重復性高的ESRD患者差異性表達的血清蛋白質(zhì)點,本研究對ESRD患者和正常人的血清蛋白質(zhì)進行雙向電泳(2DE條件摸索,優(yōu)化實驗方案,最終獲得了滿意的蛋白質(zhì)電泳圖譜,并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALD I2T OF2T OF2MS成功鑒定了任意選取的4個差異表達的蛋白點。1材料與方法11一般資料ESRD組根據(jù)葉任高主編的第五版內(nèi)科學尿毒癥診斷標準3,選擇4名病因為慢性腎小球腎炎的男性ESRD患者,年齡4160(5113811歲,為2004年10月11月深圳市人民醫(yī)院腎內(nèi)科住院病人,屬保守治療。

8、患者病情穩(wěn)定,采血前一月內(nèi)無細菌感染征象、無心衰和糖尿病等病史。血壓控制在92140/7690mmHg(1mmHg=01133kPa,平均動脈壓為(9516814mmHg。肌酐630789mol/L,平均(69890mol/L,尿量8001000m l/ d。對照組選4名該院門診男性健康體檢者。年6Bozcuk H,U slu G,Pestereli E,et al.Predict ors of distant metastasis at p resentati on in breast cancer:a study als o evaluating ass ociati ons a mong

9、 common bi ol ogical indicat ors.B reast Cancer Res Treat,2001,68(3: 239.7R i ou G,Mathieu MC,Barr ois M,et al.c-erbB-2(HER-2/neu gene a mp lificati on is a better indicat or of poor p r ognosis than p r otein over-exp ressi on in operable breast-cancer patients.I nt J Cancer,2001, 95(4:266-270.8劉彤華

10、主編.診斷病理學.北京:人民衛(wèi)生出版社,1994,577-587.收稿日期:2004-03-0173中國醫(yī)師雜志2006年1月第8卷第1期齡4060(5218716歲。血壓90132/6086mm 2Hg,平均動脈壓為(8514611mmHg 。肌酐5491(7220mol/L,尿量15002000m l/d 。12材料主要試劑及儀器13c m I PG 膠條(pH 4-7L 、24c m I PG 膠條(pH 3-10L 、尿素、硫脲、CHAPS 、2D clean 2up kit 、Auru m T MSerum Pr otein M ini Kit 、等電聚焦電泳儀、SE600垂直電泳槽

11、、Ettan DALT 垂直電泳系統(tǒng)均為Amersham B i ociences 公司產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸購自BB I 公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。溶液成分樣品溶解液、I PG 溶脹液、平衡液、銀染溶液均參照郭堯君4著蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)配制。13方法血清蛋白質(zhì)樣品制備取8名受檢對象空腹靜脈血,室溫放置30m in,離心3000g,15m in收集血清。取60l 血清用Aurum T MSeru m Pr otein M ini Kit 處理去除血清白蛋白和I gG 。再用2D clean 2up kit 或丙酮純化,樣品裂解液溶解蛋白。Lowry 法定量。雙向電泳等電聚焦電

12、泳主要按膠內(nèi)加樣方法進行,并參照I PGphor 等電聚焦系統(tǒng)操作指南5,6。S DS 2聚丙烯酰胺凝膠電泳(S DS 2P AGE 分別在SE600垂直電泳槽(13c m 膠條和Ettan DAL II 垂直電泳槽(24c m 膠條中進行。2DE 圖像采集與分析采用郭堯君4的銀染方法并作適當改動。染色的凝膠經(jīng)透射掃描用I m age Master 2D 510軟件分析,不同膠匹配點相對含量的比值2或者015認為存在差異。差異蛋白質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索酶解后的混合物經(jīng)提取肽段和自然干燥后等進行肽質(zhì)量指紋圖譜和MALD I 2T OF 2T OF 2MS 分析,所獲得圖譜在I P I human數(shù)

13、據(jù)庫總中搜索。2結(jié)果2124cm I PG 膠條(pH 3-10L 的血清蛋白質(zhì)圖譜對照組檢測到(50449個蛋白點,ESRD 組檢測到(56947個蛋白點,2組差異點的分布如圖2方框所示 。圖1 對照組圖2ESRD 組22條件優(yōu)化后的血清蛋白質(zhì)圖譜對照組檢測到蛋白點(28738個,ESRD 組檢測到(30724個蛋白點。見圖3,圖 4圖3 對照組圖4ESRD 組23質(zhì)譜鑒定2組間匹配點相對含量表達上有差異的共54個,任選其中4個差異點進行MALD I 2T OF 2T OF 2MS 鑒定,鑒定出的蛋白名稱為KI A A1627p r otein 、transthyretin 、RNA bin

14、ding motif p r otein 4、nuclear recep 2t or subfa m ily 3。3討論血清低豐度蛋白的分離常受到高豐度蛋白、脂質(zhì)、鹽類等影響,而ESRD 患者由于各系統(tǒng)代謝紊亂使得血液成分更復雜從而影響低豐度蛋白的分離和鑒定,因此建立一個專門針對ESRD 患者血清成分變化的方案才能應用蛋白質(zhì)組技術(shù)開展尿毒癥蛋白質(zhì)毒素的研究。本研究以ESRD 患者血清蛋白為樣品,對樣品制備、等電聚焦(I EF 上樣量、凝膠染色等進行比較和條件的優(yōu)化,獲得滿意的ESRD 患者血清蛋白2DE 圖譜。本研究首先用24c m (pH 3-10L 的膠條進行I EF,發(fā)現(xiàn)血清蛋白廣泛分布

15、于等電點(P I 3-10范圍,對照組檢測到(50449個蛋白點,平均匹配率為78132%;ESRD 組檢測到(56947個蛋白點,平均匹配率為82131%,經(jīng)I m age Master 2D 510凝膠軟件分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要分布在P I 415-615范圍,如圖2中方框所示處,為更清晰觀察和比較ESRD 患者差異性表達的蛋白分布情況,以下研究均采用13c m (pH 4-7L I PG 膠條。本研究根據(jù)ESRD 患者體內(nèi)代謝變化對樣品采取了如下處理:ESRD 患者因代謝紊亂導致部分蛋白產(chǎn)生和清除異常,與正常者比較主要是低豐度蛋白,因此有效去除高豐度蛋白對本研究尤為重要6。Auru m T

16、 MSerum Pr otein M ini Kit 能特異吸附白蛋白和I gG,經(jīng)其處理后樣品圖譜中的低豐度蛋白分布區(qū)域顯示清晰,分辨率明顯提高。ESRD 患者有鹽等多種小分子物質(zhì)潴留在血中,樣品含的這些物質(zhì)將影響I EF,使電壓難以達到I EF 所需,最終影響2DE效果7。本研究選用丙酮沉淀和2D clean 2up kit 純化樣品,與處理前相比這兩種方法均能得到清晰的蛋白83Journal of Chinese Physician,January,2006,Vol 8,No1點。但丙酮處理會致血清P I6-7處蛋白丟失,影響該區(qū)域差異蛋白的比較,為確保差異表達的蛋白均能呈現(xiàn)出來本研究采

17、用前者來處理樣品。傳統(tǒng)蛋白溶解液一般含有Tris,本研究發(fā)現(xiàn)含Tris的血清蛋白樣品在I EF時電壓常難達到8000伏,并出現(xiàn)大量水平紋。樣品蛋白含量測定的準確性會直接影響I EF上樣量的確定和2DE圖譜蛋白點的多少,ESRD患者如果血清樣品蛋白上樣量太低,有可能影響低豐度表達的尿毒癥蛋白質(zhì)毒素比較,本研究采用的蛋白不同上樣量中,100g蛋白能得到最佳的圖譜效果,有差異表達的低豐度區(qū)域蛋白點顯示清晰,高豐度蛋白區(qū)域又不太明顯。染色方法有多種,考馬斯亮藍染色雖特異性高,但上樣量大,對本研究不適用,經(jīng)不斷摸索改良了傳統(tǒng)的銀染方案,最終得到滿意的銀染電泳圖譜。為清晰觀察ESRD患者血清蛋白質(zhì)譜的分布

18、范圍,本研究首先使用24c m pH3-10L膠條為第一向等電聚焦,第二向采用垂直S DS2P AGE,Ettan DAL II垂直電泳槽系統(tǒng)。經(jīng)軟件初步分析,發(fā)現(xiàn)ESRD患者和正常人表達有差異的蛋白主要分布在P I415-615范圍。故本研究最終采用13c m膠條進行蛋白分離,獲得了理想分離效果。通過對以上幾種有可能影響血清蛋白質(zhì)2DE的各因素比較,本研究獲得了優(yōu)化的研究ESRD患者血清蛋白質(zhì)圖譜變化的方案,即:使用Auru m T M Serum Pr otein M ini Kit親和吸附去除血清中白蛋白和I gG、2D clean2up kit純化蛋白樣品、使用不含有Tris的蛋白溶解

19、液、用13c m I PG膠條(pH4-7L進行I EF、使用改良的銀染方案,圖3和圖4是根據(jù)此方案而分別得到的正常人和ESRD患者血清蛋白2DE銀染圖譜。在相同條件下,分別對2組樣品進行3次2DE,圖譜經(jīng)軟件分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計后顯示:正常者檢測到(28738個蛋白點,平均匹配率為84132%;ESRD患者檢測到(30724個蛋白點,平均匹配率為90155%,提示本研究采用的蛋白質(zhì)2DE方案有較好重現(xiàn)性。血清蛋白質(zhì)P I和分子量分布范圍很廣,但與正常人相比有差異的ESRD患者蛋白點多數(shù)集中于P I415-615,表達差異的蛋白質(zhì)點有54個。為明確建立的電泳方案和銀染方法與質(zhì)譜是否兼容,遂從54個有

20、差異的點中隨機選取4個在不同批次膠上重復性好的差異表達蛋白點進行MALD I2T OF2T OF2MS鑒定,鑒定出的蛋白為KI A A1627p r otein、transthyretin、RNA binding motif p r o2 tein4、nuclear recep t or subfa m ily3。通過對影響ESRD患者血液蛋白質(zhì)組2DE各種條件的比較,可認為本研究目前建立的ESRD患者血清蛋白2DE,能全面滿足研究ESRD患者血清中異常表達的蛋白質(zhì),為尿毒癥蛋白質(zhì)毒素的研究提供了一個早期實驗平臺。參考文獻1侯凡凡.對尿毒癥毒素的新認識.中華腎臟病雜志,2003,19(2:69

21、 -70.2H ille J M,Freed AL,W atzig H.Possibilites t o i m p r ove aut omati on, s peed and p recisi on of p r oteome analysis:a comparisi on of t w o-di m en2 si onal electr ophoresis and alternative.Electr ophoresis,2001,22(5: 4035-4052.3葉任高.慢性腎衰竭.見葉任高,內(nèi)科學.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2001,569-579.4郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù).北京:

22、科學出版社,1999,141-142.5Elisabetta G,I vano E,Anna A,et al.A Pr oteom ic I nvestigati on of Is o2 lated Soy Pr oteins with Variable Effects in Experi m ental and Clinical Studies.J Nutr,2003,133(1:9-14.6Rachel A,Craven,NT,Patricia H,et al.Laser Cap ture M icr odissecti on and T wo-D i m ensi onal Polyac

23、ryla m ide Gel Electr ophoresis:Evaluati on of Tissue Preparati on and Sa mp le L i m itati ons.Am J Pathol,2002,160(3:815-822.7屠成劍.樣品的全息制備.見夏其昌,蛋白質(zhì)化學與蛋白質(zhì)組學.北京:科學出版社,2004,263-264.收稿日期:2005-08-29(上接第33頁2Yu XQ,W u LL,Huang XR,et al.O steopontin exp ressi on in p r ogressive renal injury in re mnant kidney:r ole of angi otensin.Kindey I nt,200, 58:1469-1480.3Wolt m an AM,de Haij S,Boonstra JG,et al.I nterleukin-17and CD40 -ligand synergistically enhance cyt okine and che mokine p r oducti on by renal ep ithelial cells.J Am So