脂質(zhì)體電動色譜法評價阿魏酸與生物膜的相互作用

1、脂質(zhì)體電動色譜法評價阿魏酸與生物膜的相互作用        【摘要】     利用脂質(zhì)體與生物膜結(jié)構(gòu)的相似性，將脂質(zhì)體加入毛細(xì)管電泳緩沖溶液中作為假固定相，在數(shù)分鐘內(nèi)測定了阿魏酸的脂水分配系數(shù)Klw，建立了脂質(zhì)體電動色譜評價阿魏酸與生物膜相互作用的方法。研究了脂質(zhì)體中膽固醇的含量、緩沖溶液pH值和緩沖體系對Klw的影響。結(jié)果表明，在實驗條件范圍內(nèi)（膽固醇含量030%，pH值4.012.0），膽固醇含量升高，緩沖溶液pH值增大，Klw降低；在不同的緩沖體系中，離子強(qiáng)度

2、越大，Klw越大。脂水分配系數(shù)的變化反映了阿魏酸與生物膜相互作用。     【關(guān)鍵詞】  脂質(zhì)體電動色譜 阿魏酸 生物膜 脂水分配系數(shù)    1  引言    藥物與生物膜的相互作用在定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系（quantitative structure activity relationship，QSAR）中應(yīng)用廣泛，已成為一個重要的研究領(lǐng)域1。而脂質(zhì)體是一種合適的生物膜模型，藥物在脂質(zhì)體相和水相的分配系數(shù)（Klw）可作為評價藥物膜相互作用的尺度，提供某種藥物透過生物膜難

3、易程度的信息25。傳統(tǒng)測定Klw方法較繁瑣、耗時，且需要高純度和大體積的樣品。    脂質(zhì)體電動色譜（LEKC）61結(jié)合了脂質(zhì)體同生物膜結(jié)構(gòu)的相似性和毛細(xì)管電泳的快速高效性，在研究藥物與生物膜相互作用中表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢。如簡便、快速、自動化和微量。應(yīng)用LEKC測定Klw僅需幾分鐘，而傳統(tǒng)方法需幾小時甚至幾天。Zhang等首先嘗試用LEKC分析藥物與生物膜相互作用。Burns建立了線形溶解能關(guān)系式（linear solvation energy relationship， LSER），揭示了各種不同類型的作用力對藥物進(jìn)入脂質(zhì)體的貢獻(xiàn)。Carrozzino，研究了緩

4、沖液pH值及緩沖體系對堿性藥物Klw的影響。而酸性藥物阿魏酸Klw的測定及影響因素尚未見報道。本研究采用LEKC方法快速測定了阿魏酸的Klw，同時考察了脂質(zhì)體中膽固醇的含量，緩沖溶液的pH值和緩沖體系對阿魏酸Klw的影響。2  實驗部分2.1  儀器與試劑    P/ACETM MDQ 型高效毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Beckman Coulter，USA)， 配有二極管陣列檢測器(DAD) 及儀器操作和數(shù)據(jù)采集軟件(32 Karat Software)；未涂敷熔融石英毛細(xì)管， 60 cm (有效長度50 cm)×50 m i.d. (河北永年

5、光導(dǎo)纖維廠)；pHS25型酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司)。阿魏酸(Sigma 公司)； 膽固醇（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；卵磷脂（serva 公司）；所用水為二次蒸餾水；其它試劑均為分析純； 0.45 m微孔濾膜（上海新亞凈化儀器廠）。2.2  脂質(zhì)體的制備    稱取一定量卵磷脂和膽固醇于50 mL圓底燒瓶中，加10 mL有機(jī)溶劑（氯仿）（甲醇）=9010）使其充分溶解。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于65 在最大轉(zhuǎn)速時旋轉(zhuǎn)減壓蒸去溶劑，可見一層透明的膜附著于燒瓶上，真空干燥過夜。在所得產(chǎn)物中加入10 mL 10 mmol/L 緩沖溶液，將圓底燒瓶置于65

6、 熱水浴中旋渦水合2 h后超聲40 min，定容至10 mL。2.3  電泳條件    檢測波長：214 nm；壓力進(jìn)樣：3.47 kPa×5 s；溫度：25 ；電壓：24 kV；運(yùn)行緩沖液為10 mmol/L磷酸鹽或含脂質(zhì)體的磷酸鹽或其它緩沖體系。實驗時毛細(xì)管用0.1 mol/L NaOH沖洗3 min，再用純水沖洗2 min，最后用背景緩沖液沖洗5 min。每次更換緩沖液時均用新緩沖液清洗5 min。樣品進(jìn)樣前需超聲以脫氣，過0.45 m 濾膜, 以保證實驗的重復(fù)性。2.4  溶液的配制    精確稱

7、取阿魏酸10 mg，置于10 mL容量瓶中以甲醇定容，用微量移液器吸取0.5 mL移入5 mL容量瓶中，再以甲醇定容，制得濃度為100 mg/L的樣品溶液。    2.5  計算方法    脂質(zhì)體與生物膜的結(jié)構(gòu)相似性為LEKC描述藥物膜相互作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，藥物在含有脂質(zhì)體溶液毛細(xì)管中的遷移時間與不含脂質(zhì)體溶液中的遷移時間的變化能夠反映藥物與膜的相互作用。遷移時間取重復(fù)3次的平均值。LEKC的容量因子（k）涵蓋了藥物與脂質(zhì)體的疏水、靜電及其它氫鍵、空間位阻等作用。Klw代表了溶質(zhì)在脂質(zhì)體相和水相的分配，可用來描述與脂質(zhì)體結(jié)

8、合的程度，進(jìn)而評價藥物與膜的相互作用。藥物在LEKC上的容量因子與脂水分配系數(shù)成線性比例，利用公式(1)(4)可計算LEKC中藥物的容量因子（k）、脂水分配系數(shù)(k)和吉布斯自由能變化值（）4,11。k（tt）/t（）k為容量因子，t為毛細(xì)管電泳緩沖溶液含脂質(zhì)體時(即脂質(zhì)體電動色譜，LEKC)藥物的遷移時間，t則為緩沖溶液無脂質(zhì)體時（即毛細(xì)管區(qū)帶電泳，capillary zone electrophoresis， CZE）藥物的遷移時間。k=Klwlw(VlipVaq)=Klwv（)（v*（）（）v=（x×v）（）為相比，v 為總的偏摩爾特征體積（據(jù)式3計算），P為脂質(zhì)體總濃度，CA

9、C 為臨界聚集濃度，接近于01，x 為脂質(zhì)體中各種組分的摩爾百分比。v為脂質(zhì)體中各種組分的偏摩爾特征體積，參照文獻(xiàn)1，1計算。 gTln（tt）（）Rg為標(biāo)準(zhǔn)氣體常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度。3  結(jié)果與討論3.1  膽固醇含量對Klw的影響    在脂質(zhì)體制備過程中加入不同比例的膽固醇，阿魏酸的Klw的對數(shù)值如圖1所示。膽固醇含量為0、10%、20%和30%時，lgKlw值分別為2.44、2.40、2.33和2.25。可以看出，Klw在脂質(zhì)體無膽固醇時最大，且隨著脂質(zhì)體中膽固醇含量的增加而減小。    

10、0; 圖1  膽固醇含量對lgKlw的影響（略）Fig.1  Effect of cholesterol contents on lgKlw緩沖液（buffer）：10 mmol/L磷酸鹽(phosphate)，pH 7.0。膽固醇含量由0變化到30%，由式（2）和式（3）計算得知，相比的變化可忽略，故影響Klw的主要因素為阿魏酸在CZE和LEKC中遷移時間。而遷移時間的變化反映了藥物與生物膜的相互作用。膽固醇像“緩沖劑”一樣起著調(diào)節(jié)生物膜結(jié)構(gòu)流動性的作用。膽固醇本身不形成脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，但它能以高濃度方式摻入磷脂膜，引起膜性質(zhì)的變化。膽固醇分子在雙層中的取向是其羥基緊靠磷脂

11、分子的極性頭部，其板狀的固醇環(huán)緊接極性頭部的碳?xì)滏渽^(qū)域，并與之相互作用。隨著脂質(zhì)體中膽固醇含量的增加，酰基鏈的自由度降低，從而使得脂質(zhì)雙層排列更加緊密，脂質(zhì)體的剛性和有序性增加，流動性降低，故藥物進(jìn)入脂質(zhì)體難度增加，分配進(jìn)入脂質(zhì)體的量減少，即Klw減小。3.2  緩沖溶液pH值對Klw的影響    毛細(xì)管壁硅醇基的解離常數(shù)1為1.0×10-3，故pH    不同pH緩沖液中阿魏酸的吉布斯自由能變化值如圖2b所示。G隨緩沖溶液的pH值的增大而增大。G越小，說明藥物與脂質(zhì)體的相互作用越強(qiáng)，藥物更易進(jìn)入生物膜內(nèi)。

12、0; 圖2  緩沖液pH值對Klw(a)和(b)的影響（略）Fig.2  Effect of pH on Klw (a) and （b） of ferulic acid緩沖液（buffer): 10 mmol/L 磷酸鹽(phosphate)。3.3  緩沖體系對Klw的影響    阿魏酸在硼酸鹽、磷酸鹽和Tris(三羥甲基胺基甲烷)緩沖溶液中CZE和LEKC譜圖如圖3所示。圖中為阿魏酸在CZE中的峰位置， 2為阿魏酸在LEKC中的峰位置。緩沖液pH值為7.0，濃度均為10 mmol/L。從圖3中可以看出阿魏酸在相同濃度不同緩沖體系中

13、遷移時間差別較大。測試方式為CZE時，阿魏酸在硼酸鹽、磷酸鹽和Tris緩沖溶液中的遷移時間分別為13.13、3.82和5.94 min。測試方式為LEKC時，阿魏酸的遷移時間分別為19.41、5.29和7.49。硼酸鹽、磷酸鹽和Tris緩沖溶液中阿魏酸Klw的對數(shù)值分別為2.32、2.23和2.05。硼酸鹽緩沖液中Klw值最大，其次為磷酸鹽和Tris緩沖溶液，這可能與緩沖溶液離子強(qiáng)度有關(guān)。3種緩沖溶液在相同濃度下調(diào)節(jié)pH后，離子強(qiáng)度大小為：硼酸鹽>磷酸鹽>Tris。阿魏酸的Klw值隨緩沖溶液的離子強(qiáng)度的增大而增大。Carrozzino10發(fā)現(xiàn)在LEKC中，帶正電荷的溶質(zhì)隨著離子強(qiáng)度

14、的增大，分配系數(shù)減小。這與本實驗結(jié)果是一致的。圖3  阿魏酸的（）和（）在不同緩沖液中的圖譜（略）ig.3  Capillary zone electrophoresis (CZE) (1) and liposome electrokinetic chromatogram (LEKC)(2) of ferulic acid in different buffera: 10 mmol/L硼酸鹽(borate), pH 7.0; b: 10 mmol/L磷酸鹽(phosphate), pH 7.0; c: 10 mmol/L tris, pH 7.0。這是因為緩沖溶液的離子不僅

15、對溶質(zhì)分子的電荷起屏蔽作用，而且對脂質(zhì)體表面的電荷也有屏蔽作用。溶質(zhì)帶正電荷時，緩沖溶液的離子屏蔽了溶質(zhì)的正電荷和脂質(zhì)體的負(fù)電荷，削弱了溶質(zhì)和脂質(zhì)體的靜電作用，分配系數(shù)減小。而在本實驗條件下（pH7.0），溶質(zhì)帶負(fù)電荷，緩沖溶液的離子屏蔽了溶質(zhì)的負(fù)電荷和脂質(zhì)體的負(fù)電荷，減弱了溶質(zhì)和脂質(zhì)體的排斥作用，兩者之間的結(jié)合程度增大，故分配系數(shù)增大。3.4  結(jié)論    實驗結(jié)果表明，膽固醇的加入降低了脂質(zhì)體的流動性，使藥物在脂質(zhì)體中的分配減小，Klw降低。緩沖溶液pH升高，阿魏酸的解離程度增大，與脂質(zhì)體相互作用減弱，Klw降低。pH7.0時，在3種緩沖體系中（硼酸

16、鹽、磷酸鹽和Tris溶液），離子強(qiáng)度越大，離子對藥物和脂質(zhì)體的負(fù)電荷的屏蔽作用越強(qiáng)，減弱了藥物與脂質(zhì)體的排斥作用，Klw升高。    【參考文獻(xiàn)】  1 Raevsky O A, Schaper K J. Eur J Med Chem, 1998, 33(10): 7998072 Yang Q, Liu X Y, Umetani K. Bio. Acta, 1999, 1417(1): 1221303 Wang Zhiuan(王志宣), Deng Yingie（鄧英杰）, Zhang Xiaoeng（張曉鵬）. Chinese J. Acta

17、Pharm. Sin(藥學(xué)學(xué)報), 2006, 41 (4): 3183224 Sheng LiangHong(盛亮洪), Li Ping(李 萍), Zou HanFa(鄒漢法). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)), 2005, 33(1): 13165 Sun Yue(孫 悅), Yin XueFeng(殷學(xué)鋒), Lu Min(盧 敏). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)), 2007, 35(4): 4694736 Zhang Y, Zhang R, Hjertén S, Lundahl P. Electrophoresis, 1

18、995, 16(1): 151915237 Burns S T, Agbodjan A A, Khaledi M G. J.Chromatogr. A, 2002, 973(12): 1671768 Wiedmer S K, Jussila M S, Holopainen J M, Alakoskela J M, Kinnunen P K J, Riekkola M L. J.Sep. Sci, 2002, 25(7): 4274379 Carrozzino J M, Khaledi M G. J Chromatogr A, 2005, 1079(12): 30731610 Carrozzino J M, Khaledi M G. Pharm. Res., 2004, 21(12): 2327233511 Wang Yongun(王永軍), Sun Jin(孫 進(jìn)), He Zhongui(何仲貴). Chinese J. Acta Pha