基因工程課件

1、基因工程1第七章第七章 基因工程基因工程 (gene engineering)基因工程2 重組重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)產(chǎn) 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進(jìn)凝血促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成剌激白細(xì)胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化刺激細(xì)胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素白細(xì)

2、胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預(yù)防乙肝預(yù)防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂預(yù)防霍亂基因工程3基因工程4 基因工程的操作過程酶切酶切連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化擴(kuò)增擴(kuò)增檢測目的基因的獲取目的基因的獲取 克隆載體的構(gòu)建克隆載體的構(gòu)建外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接（體外重組）（體外重組）重組重組DNA導(dǎo)入受體菌導(dǎo)入受體菌轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá)基因工程5基因工程6第

3、二節(jié)第二節(jié) 核酸的提取及檢測核酸的提取及檢測基因工程7基因工程8基因工程92. cDNA的分離與純化的分離與純化基因工程10依賴依賴RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶基因工程11基因工程12基因工程13基因工程14（2）第一鏈的合成）第一鏈的合成基因工程15 （3）第二鏈的合成）第二鏈的合成 cDNA第二鏈的合成方法第二鏈的合成方法自身引導(dǎo)法自身引導(dǎo)法 基因工程16自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用自身引導(dǎo)合成法較難控制反應(yīng)，而且用S1核酸酶核酸酶切割切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)無一例外地將導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5端序

4、列端序列出現(xiàn)缺失和重排，因而該方法目前出現(xiàn)缺失和重排，因而該方法目前很少使用很少使用。基因工程17基因工程18cDNA第二鏈的合成方法第二鏈的合成方法置換合成法置換合成法DNApol dNTPsRNaesH5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligase該方法使用較多該方法使用較多基因工程19基因工程20基因工程21基因工程22

5、 基因工程23基因工程24基因工程25凝膠凝膠 Agarose 0.3 500001000 0.7 200001000 1.4 6000300PAG 4.0 1000100 10.0 50025 20.0 501基因工程26EB可檢測到可檢測到ng級的級的DNA，熒光強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度與DNA數(shù)量成數(shù)量成正比正比基因工程27操作過程操作過程基因工程28基因工程29DNA分子大小的檢測分子大小的檢測NEB，1Kb DNA Ladder：3kb=62.5ng， 1kb=21.0ngPCR產(chǎn)物產(chǎn)物3Kb1Kb基因工程30E.Southern，1975基因工程31 基因工程32PCR原理：原理：請注意引物

6、結(jié)合的位置請注意引物結(jié)合的位置基因工程33基因工程34基因工程35基因工程36基因工程37基因工程38基因工程39質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體AmprlacZMCSPT7oriPSP6pGEM3z基因工程40基因工程414. DNA的體外重組的體外重組基因工程42EcoR5 33 5 回文序列回文序列 palindromic seq限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶基因工程43Sma ICCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC 粘性末端粘性末端 cohensive end 平末端平末端 blunt end基因工程44基因工程45基因工程46 基因工程47基因工程48目的基因目的基因載體載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶連接酶載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連重組體重組體基因工程49基因工程50基因工程51乳糖操縱子乳糖操縱子l LacZ基因編碼半乳糖苷酶基因編碼半乳糖