浙江大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)甲SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量ppt課件

1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量1.1、原理、原理電泳法分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主電泳法分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形要是根據(jù)各蛋白質(zhì)組分的分子大小和形狀以及所帶靜電荷的多少等因素所造成狀以及所帶靜電荷的多少等因素所造成的電泳遷移率的差別。蛋白質(zhì)分子在外的電泳遷移率的差別。蛋白質(zhì)分子在外加電場下的泳動行為可用下列函數(shù)式表加電場下的泳動行為可用下列函數(shù)式表示：示： EQV = 6rv：分子泳動速度：分子泳動速度 Q ：分子所帶凈電荷：分子所帶凈電荷E：電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度 r ：分子半徑：分子半徑：介質(zhì)粘度：介質(zhì)粘

2、度SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基磺酸鈉烷基磺酸鈉SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量的大小，而其它因素對電泳主要取決于它的分子量的大小，而其它因素對電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計。遷移率的影響幾乎可以忽略不計。 SDS是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。分子團(tuán)的混合形式存在。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量

3、測定蛋白質(zhì)的分子量 這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其這種陰離子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變它物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的空間構(gòu)象，特別是在強(qiáng)還原劑，如巰基乙醇原有的空間構(gòu)象，特別是在強(qiáng)還原劑，如巰基乙醇存在下，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，從而存在下，由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，從而保證了蛋白質(zhì)分子與保證了蛋白質(zhì)分子與SDS能充分結(jié)合，形成帶負(fù)電能充分結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)荷的蛋白質(zhì)- SDS復(fù)合物。復(fù)合物。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 這種復(fù)合物由

4、于結(jié)合了大量的這種復(fù)合物由于結(jié)合了大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異。分子之間天然的電荷差異。 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還會引起蛋白質(zhì)分子發(fā)生構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還會引起蛋白質(zhì)分子發(fā)生構(gòu)象的改變，使蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀近似象的改變，使蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的形狀近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物復(fù)合物的短軸長度都一樣，約為的短軸長度都一樣，約

5、為1.8nm，長軸則隨蛋白質(zhì)，長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比變化。分子量成正比變化。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 這樣的蛋白質(zhì)這樣的蛋白質(zhì)- SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度，也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。的長度，也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量之間時，蛋白之間時，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，質(zhì)分子的電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下列方程式：符合

6、下列方程式：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 lgMw = -b mR + K Mw：蛋白質(zhì)的分子量：蛋白質(zhì)的分子量 mR：相對遷移率：相對遷移率 b： 斜率斜率 K ：截距：截距 當(dāng)條件一定時，當(dāng)條件一定時，b，K 均為常數(shù)，即此時均為常數(shù)，即此時lgMw 與與mR的關(guān)系為線性關(guān)系，的關(guān)系為線性關(guān)系， 如以如以lgMw對對mR作圖，應(yīng)作圖，應(yīng) 得到一條直線，如右圖：得到一條直線，如右圖：lgMwmR待測待測mR待測待測lgMwSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 如將已知分子量的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相

7、對遷移率對如將已知分子量的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對遷移率對分子量作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在分子量作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得該蛋白質(zhì)的分子量。標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得該蛋白質(zhì)的分子量。 電泳用的支持介質(zhì)為凝膠，常用的有聚丙烯酰胺凝電泳用的支持介質(zhì)為凝膠，常用的有聚丙烯酰胺凝膠膠(PAGE)和瓊脂糖凝膠和瓊脂糖凝膠agarose）。本試驗(yàn)用聚）。本試驗(yàn)用聚丙烯酰胺凝膠。丙烯酰胺凝膠。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯

8、酰胺單體，聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，Acr和甲和甲叉雙丙烯酰胺雙體，叉雙丙烯酰胺雙體，Bis在催化劑在催化劑TEMED和引發(fā)劑和引發(fā)劑AP或或VitB2作用下聚合而成的三維網(wǎng)作用下聚合而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 單體和雙體單獨(dú)存在或混合在一起都是相對穩(wěn)定的，單體和雙體單獨(dú)存在或混合在一起都是相對穩(wěn)定的，若有自由基存在則可引發(fā)二者的聚合。若有自由基存在則可引發(fā)二者的聚合。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 自由基引發(fā)的方式有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種，前者自由基引發(fā)的方式有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種，前者的引發(fā)劑是過硫酸胺的引發(fā)劑是過硫酸胺

9、AP），后者的引發(fā)劑是核），后者的引發(fā)劑是核黃素黃素VitB2）。兩種方法的催化劑都是四甲基乙）。兩種方法的催化劑都是四甲基乙二胺二胺TEMED）。）。 在一定濃度范圍內(nèi)，改變聚合體系中在一定濃度范圍內(nèi)，改變聚合體系中Acr和和Bis的比的比例，可得到不同網(wǎng)眼大小的凝膠，由于凝膠的三維例，可得到不同網(wǎng)眼大小的凝膠，由于凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對在凝膠中泳動的不同分子量的質(zhì)點(diǎn)有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對在凝膠中泳動的不同分子量的質(zhì)點(diǎn)有著選擇和阻礙，因此使凝膠本身又具有分子篩效應(yīng)。著選擇和阻礙，因此使凝膠本身又具有分子篩效應(yīng)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 聚丙烯

10、酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng)兩種，聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)和不連續(xù)系統(tǒng)兩種，不連續(xù)電泳系統(tǒng)是采用兩種不同的緩沖液配制兩種不連續(xù)電泳系統(tǒng)是采用兩種不同的緩沖液配制兩種不同濃度的凝膠，它可使樣品在兩層膠的界面處濃不同濃度的凝膠，它可使樣品在兩層膠的界面處濃縮，從而大達(dá)提高了電泳的分辨率，使之特別適用縮，從而大達(dá)提高了電泳的分辨率，使之特別適用于稀樣品的分離。于稀樣品的分離。 聚丙烯酰胺凝膠電泳法的特點(diǎn)：簡便、快速、重復(fù)聚丙烯酰胺凝膠電泳法的特點(diǎn)：簡便、快速、重復(fù)性好，只需幾微克的樣品即可進(jìn)行測定。當(dāng)分子量性好，只需幾微克的樣品即可進(jìn)行測定。當(dāng)分子量范圍在范圍時，

11、所測得的結(jié)果與用其它時，所測得的結(jié)果與用其它方法測得的結(jié)果相比，誤差一般不超過方法測得的結(jié)果相比，誤差一般不超過10%。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量1.2、材料與試劑、材料與試劑1、試驗(yàn)材料、試驗(yàn)材料新鮮植物葉片大蒜、菠菜、韭菜）新鮮植物葉片大蒜、菠菜、韭菜）2、試驗(yàn)試劑、試驗(yàn)試劑SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 稱號稱號 分子量（分子量（104D） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 11.60 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 6.62 雞卵清蛋白雞卵清蛋白 4.50 乳酸脫氫酶乳酸脫

12、氫酶 3.50 核酸內(nèi)切酶抑制劑核酸內(nèi)切酶抑制劑 2.50 -乳球蛋白乳球蛋白 1.84 雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶 1.44 其它試劑及使用時的注意事項參見其它試劑及使用時的注意事項參見P67。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量1.3、操作方法、操作方法1、凝膠的制備、凝膠的制備試劑名稱試劑名稱 12%分離膠分離膠 4%濃縮膠濃縮膠30.8%膠母液膠母液 3 ml 0.35mlTris-HCl (pH 8.9) 0.9 ml Tris-HCl (pH 6.7) 0.3 ml10%SDS 75 ul 25ulTEMED原液）原液） 4 ul 5 u

13、lH2O 3.5 ml 2.3 ml10%過硫酸銨過硫酸銨AP） 60 ul 25 ul SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量2、樣品的提取及處理、樣品的提取及處理、樣品的提取、樣品的提取取新鮮葉片，沖洗干凈，吸干表面水分，去掉葉脈，取新鮮葉片，沖洗干凈，吸干表面水分，去掉葉脈，稱取去脈葉片稱取去脈葉片0.5g，加入，加入0.05mol/L pH7.8的磷酸緩的磷酸緩沖液沖液2ml，加石英砂少許研磨成勻漿，加石英砂少許研磨成勻漿，10000r/min離心離心10min，上清備用。，上清備用。、樣品的處理、樣品的處理取取30ul待測樣品的上清于離心管

14、中，加入待測樣品的上清于離心管中，加入30ul濃樣品濃樣品溶解液，混勻，置于溶解液，混勻，置于100水浴中保溫水浴中保溫35min，取，取出冷卻備用。出冷卻備用。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的分子量 若待測樣品濃度太稀應(yīng)事先濃縮；若樣品鹽濃度太若待測樣品濃度太稀應(yīng)事先濃縮；若樣品鹽濃度太高則需先行透析，再進(jìn)行上述處理。高則需先行透析，再進(jìn)行上述處理。 其它操作步驟及注意事項解說詳見其它操作步驟及注意事項解說詳見P68。 1.4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及處理、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及處理 用直尺分別量出染料的遷移距離和各樣品區(qū)帶的遷用直尺分別量出染料的遷移距離和各樣品區(qū)帶的遷移距離，如下圖：移距離，如下圖： 按下列公式計算相對遷移率按下列公式計算相對遷移率mR：0加加樣樣濃縮膠濃縮膠染染料料遷遷移移距距離離樣樣品品遷遷移