生化實驗講義：實驗九--酵母蔗糖酶(最后)

1、實驗九 酵母蔗糖酶的提取及其性質的研究本實驗為學生提供一個較全面的實踐時機，學習如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對這種酶的性質，尤其是動力學性質作初步的研究。自 1860 年 Bertholet 從酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來， 它已被 廣 泛 地 進 行 了 研 究 。 蔗 糖 酶 invertase D 呋 喃 果 糖 苷 果 糖 水 解 酶 fructofuranoside fructohydrolase EC.3.2.1.26 特異地催化非復原糖中的 呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解

2、，生成密二糖和果糖。本實驗提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細胞膜的外側和內側， 在細胞膜外細胞壁中的稱之為外蔗糖酶 external yeast invertase , 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在細胞膜內側細胞質中的稱之為內蔗糖酶internal yeast invertase，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質部分均為雙亞基，二聚體， 兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個亞基比內酶多兩個氨基酸，Ser和Met,它們的分子量也不同，外酶約為27萬（或22萬，與酵母的來源有關），內酶約為萬。盡管這兩種酶在組成上有較大的差異，但其底物專一性和動力學性質

3、仍十分相似，因此，本 實驗未區(qū)分內酶與外酶，而且由于內酶含量很少，極難提取，本實驗提取純化的主要是 外酶。兩種酶的性質對照表如下：名 稱M w糖含 量皿基底物 為蔗 糖的 Km底物 為棉 子糖 的Km等電占八、pI最適 pH穩(wěn)定pH 范圍最適 溫度外 酶27萬（22 萬）50%雙26mM150 mM4.9(3.5 5.5)60 C內 酶<3%雙25mM150 mM5.5)實驗中，用測定生成復原糖葡萄糖和果糖的量來測定蔗糖水解的速度，在給定 的實驗條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。比活力為每毫克蛋白質的 活力單位數(shù)。本實驗共有九個分實驗：一、蔗糖酶的提取與部分純化二、離子交換

4、柱層析純化蔗糖酶三、蔗糖酶各級分活性及蛋白質含量的測定四、反應時間對產物形成的影響五、pH對酶活性的影響和最適 pH的測定六、溫度對酶活性的影響和反應活化能的測定七、底物濃度對催化反應速度的影響及米氏常數(shù)Km和最大反應速度 Vmax的測定八、尿素胭抑制蔗糖酶的實驗九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的實驗一蔗糖酶的提取與部分純化、實驗目的：學習酶的純化方法，并為動力學實驗提供一定量的蔗糖酶。.、試劑：1. 啤酒酵母2. 二氧化硅3. 甲苯使用前預冷到0以下4. 去離子水使用前冷至4左右5. 冰塊、食鹽6. 1N 乙酸7. 95% 乙醇 三、儀器：1. 研缽1 個2. 離心管3 個3. 滴管3 個4. 量

5、筒50ml1 個5. 水浴鍋1 個6. 恒溫水浴7. 燒杯100ml 2個8. 廣泛pH 試紙9. 高速冷凍離心機四、操作步驟：1. 提取 1準備一個冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。2稱取5g干啤酒酵母和20g濕啤酒酵母，稱 20mg蝸牛酶及適量約 10g二氧 化硅，放入研缽中。二氧化硅要予先研細。 3量取預冷的甲苯 30ml 緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成糊狀，約需 60 分鐘。研 磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞大部分研碎。 4緩慢加入預冷的 40ml 去離子水，每次加2ml 左右，邊加邊研磨，至少用 30 分鐘。以便將蔗糖酶充分轉入水相。 5將混合物轉入兩個離心管中，平衡后，用高速冷離心

6、機離心， 4， 10000rpm ， 10min 。如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機相。 6用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉入另一個清潔的離心管中，4 ，10000rpm ，離心 10min 。 7將清液轉入量筒，量出體積，留出測定酶活力及蛋白含量。剩余部分轉入清潔離心管中。 8用廣泛 pH 試紙檢查清液pH ，用 1N 乙酸將 pH 調至，稱為“粗級分 I ” 。2. 熱處理 1予先將恒溫水浴調到50，將盛有粗級分I 的離心管穩(wěn)妥地放入水浴中，50下保溫 30 分鐘，在保溫過程中不斷輕搖離心管。 2取出離心管，于冰浴中迅速冷卻，用4，10000rpm ，離心

7、10min 。 3將上清液轉入量筒，量出體積，留出測定酶活力及蛋白質含量稱為“熱級分II”。3. 乙醇沉淀將熱級分 II 轉入小燒杯中，放入冰鹽浴沒有水的碎冰撒入少量食鹽 ，逐滴加入等體積預冷至 20的 95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30 分鐘，再在冰鹽浴中放置10分鐘，以沉淀完全。于4， 10000rpm ，離心 10min ，傾去上清，并滴干，沉淀保存于離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然后將其放入冰箱中冷凍保存稱為“醇級分出”。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性于下一個實驗一起做 。二離子交換柱層析純化蔗糖酶一、試劑1. DEAE 纖維素： DE-23 克2. 0.5N NaOH 10

8、0ml3. 0.5 N HCL 50ml4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 緩沖液 250ml5. 0.02 mol/L pH7.3 含 0.2 mol/L 濃度 NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液 50ml二、儀器1. 層析柱2. 部分收集器3. 磁力攪拌器及攪拌子4. 50ml 小燒杯 2 個5. 玻璃砂漏斗6. 真空泵與抽濾瓶7. 精密 pH 試紙或 pH 計8. 三通管9. 止水夾10. 吸耳球11. 塑料紫外比色杯12. 電導率儀13. 尿糖試紙14. 點滴板三、操作步驟1. 離子交換劑的處理：稱取 1.5 克 DEAE 纖維素 DE-23 干粉，加入 0

9、.5mol/L NaOH 溶液約 50ml ，輕輕攪拌，浸泡至少0.5 小時不超過 1 小時 ，用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 攪勻，浸泡小時，同上，用去離子水洗至近中性， 再用 0.5 mol/L NaOH 重復處理一次， 用去離子水洗至近中性后， 抽干備用。 因 DEAE 纖維素昂貴， 用后務必回收 。 實際操作時， 通常纖維素是已浸泡過回收的，按“堿f酸”的順序洗即可，因為酸洗后較容易用水洗至中性。堿洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干后用 0.5 mol/L NaOH mol/L NaCl 溶液處理，然后水

10、洗至中性。2. 裝柱與平衡：先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近時即可上樣。3. 上樣與洗脫：上樣前先準備好梯度洗脫液，本實驗采用 20ml 0.02M pH7.3 的 Tris-HCl 緩沖液和20ml 含 0.2M 濃度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 緩沖液，進行線性梯度洗脫。取兩個相同直徑的 50ml 小燒杯， 一個裝 20ml 含 NaCl 的高離子強度溶液， 另一個裝入 20ml低離子強度

11、溶液， 放在磁力攪拌器上， 在低離子強度溶液的燒杯內放入一個小攪拌子 在細塑料管內放入一小段鐵絲，兩端用酒精燈加熱封口 ，將此燒杯置于攪拌器旋轉磁鐵的上方。將玻璃三通插入兩個燒杯中，上端接一段乳膠管，夾上止水夾，用吸耳球小心地將溶液吸入三通輕輕松一下止水夾 ，立即夾緊乳膠管，使兩燒杯溶液形成連通，注意兩個燒杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。用5ml 0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分出，注意玻璃攪棒頭必須燒園、攪拌溶解時不可將離心管劃傷 ，假設溶液混濁，則用小試管， 4000rpm 離心 除去不溶物。取1.5ml上清液即醇級分出樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋

12、白含量，將剩余的 3.5ml 清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.53.0ml/10min 。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約 20ml 緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280 降到0.1 以下，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細塑料導管放入不含NaCl 的低離子強度溶液的小燒杯中，用膠布固定塑料管，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余30ml 高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速2.53.0ml/10min 。測定每管洗脫液的 A280光吸收值

13、和電導率。使用DJS-10電導電極測定不含 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 緩沖液和含 0.2mol/L 濃度 NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液的電導率，用電導率與 NaCl 濃度作圖，利用此圖將每管所測電導率換 算成 NaCl 濃度，并利用此曲線估計出蔗糖酶活性峰洗出時的 NaCl 濃度。4. 各管洗脫液酶活力的定性測定在點滴板上每一孔內， 加一滴的乙酸緩沖液， 一滴蔗糖和一滴洗脫液， 反應 5 分鐘， 在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，1020min后觀察試紙顏色的變化。用“+”號的數(shù)目， 表示顏色的深淺， 即各管酶活力的大小。 合并活性最高的 23

14、管， 量出總體積， 并將其分成10 份， 分別倒入 10 個小試管， 用保鮮膜封口， 冰凍保存， 使用時取出一管。此即“柱級分IV ”。注意：從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始后洗下來的活性峰。在同一張圖上畫出所有管的酶活力， NaCl 濃度 可用電導率代替 和光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。三蔗糖酶各級分活性及蛋白質含量的測定一、實驗目的掌握蔗糖酶活性測定方法，了解各級分酶的純化情況。二、原理為了評價酶的純化步驟和方法，必須測定各級分酶活性和比活。測定蔗糖酶活性的方法有許多種，如費林試劑法、Nelson's試劑法、水楊酸試

15、劑法等，本實驗先使用費林試劑法，以后測米氏常數(shù) Km和最大反應速度 Vmax時再用Nelson's試劑法。費林試劑法靈敏度較高， 但數(shù)據(jù)波動較大， 因為反應后溶液的顏色隨時間會有變化，因此加樣和測定光吸收值時最好能計時。 其原理是在酸性條件下， 蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。這些具有復原性的糖與堿性銅試劑混合加熱后被氧化，二價銅被復原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與磷鉬酸作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與復原糖的量成正比，于650nm 測定光吸收值。三、試劑1. 堿性銅試劑用畢回收稱 10g 無水 NaCO3 ,加入 100ml 去離子水溶解，另稱g 酒石酸，用 10

16、0ml 去離子水溶解，混合二溶液，再加入克結晶CuSO4,溶解后定容到250ml。2. 磷鉬酸試劑用畢回收在燒杯內加入電目酸 g,鴇酸鈉g, 10% NaOH 100ml,去離子水100ml,混合后煮沸 約 30min 小心不要蒸干 ，驅去鉬酸中存在的氨，直到無氨味為止，冷卻后加 85%磷 酸63ml,混合并稀釋到250ml。3. 0.25%苯甲酸200ml ，配葡萄糖用，防止時間長溶液長菌，也可以用去離子水代替。4. 葡萄糖標準溶液： 1貯液：精確稱取無水葡萄糖應在105恒重過克，以 0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到 100ml 容量瓶中濃度10mmol/L 。 2操作溶液：用移液管取貯液

17、10ml ，置于 50ml 容量瓶中，以用 %苯甲酸或去離子水稀釋至刻度濃度為 2mmol/L 。5. 蔗糖溶液50ml ，分裝于小試管中冰凍保存，因蔗糖極易水解，用時取出一管化凍后搖勻。6. 乙酸緩沖液， ， 200ml 。7. 牛血清清蛋白標準蛋白質溶液濃度范圍： 200500 g/ml,精確配制50m門。8. 考馬斯亮蘭G-250 染料試劑， 100mg 考馬斯亮蘭G-250 全溶于 50ml 95% 乙醇后，加入 120ml 85% 磷酸，用去離子水稀釋到 1L 公用 。 四、儀器1. 試管20 支，試管架1 個2. 秒表1 塊，或用手表。3. 移液管： 、 、 、4. 塑料可見比色杯

18、杯上和器皿染色后可用少量95% 的乙醇蕩洗5. 水浴鍋6. 電爐7. 保鮮膜8. 橡皮筋五、各級分蛋白質含量的測定采用考馬斯亮蘭染料法 Bradford 法 的微量法測定蛋白質含量， 參見 實驗 “蛋白質含量的測定法” 因 Tris 會干擾 Lowry 法的測定 。標準蛋白的取樣量為 0.1、 0.2、0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.8、 1.0ml ，用去離子水補足到 1.0ml 。各級分先要仔細尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細記錄稀釋倍數(shù)的計算使用移液管和量筒稀釋 。以下稀釋倍數(shù)僅供參考：粗級分I:1050倍熱級分II :1050倍醇級分III:1050倍柱級分 IV ： 不

19、稀釋確定了稀釋倍數(shù)后，每個級分取3 個不同體積的樣進行測定，然后取平均值，計算出各級分蛋白質濃度。六、級分 I 、 II 、 III 蔗糖酶活性測定用乙酸緩沖液也可以用pH56的去離子水代替稀釋各級分酶液，試測出測酶活合適的稀釋倍數(shù)：I :100010000 倍II :1000 10000 倍III :100010000 倍以上稀釋倍數(shù)僅供參考。按 “表 1 ” 的順序在試管中加入各試劑，進行測定， 為簡化操作可取消保鮮膜封口， 沸水浴加熱改為用9095 c水浴加熱810min。七、柱級分IV 酶活力的測定1. 酶活力的測定參照“表1”設計一個表格，反應混合物仍為 1ml 。2. 第 1 管仍

20、為蔗糖對照，9、 10 管為葡萄糖的空白與標準，與“表1”中的 11、 12管相同。3. 27管加入柱級分IV取樣前先試測出合適的稀釋倍數(shù)，分別為0.02 ml、0.05 ml、0.1 ml ml 、 0.4 ml 和，然后各加乙酸緩沖液 ，每管用去離子水補充到。4. 17 管各加入 0.2 ml 的蔗糖，每管由加入蔗糖開始計時，室溫下準確反應10min ，立即加入 1ml 堿性銅試劑中止反應，然后按“表1”中的步驟進行測定。5. 第 8 管為 0 時間對照，與第 7 管相同，只是在加入蔗糖之前，先加入堿性銅試劑， 防止酶解作用。此管只用于觀察，不進行計算。6. 計算柱級分IV 的酶活力： U

21、nits / ml 原始溶液。7. 以每分鐘生成的復原糖的 moles 數(shù)為縱座標，以試管中 1ml 反應混合物中的酶濃 度 mg 蛋白 /ml 為橫座標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。表1 級分I、n、出的酶活力測定各管名稱-對照粗級分I熱級分口醇級分W葡萄糖管數(shù)-12 3456 78 9 1011 12酶液（ml）0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50/H2O(ml)乙酸緩沖液(0.2mol/L pH4.9)0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/葡萄糖2mmol/L0.20.20.20.20.20.20.20.20

22、.20.2/加入蔗糖，立即搖勻開始計時，室溫準確反應10min后，立即加堿性銅 試劑中止反應。堿性銅試劑用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱8min,立即用自來水冷卻。磷鋁酸試劑H2OA650nmE'= g mol/min ml平均E'g mol/min mlUnits/ml原始組分稀釋后酶液的活力（按復原糖計算）：EA650 0.2 2( m moles)A'650 1 0 B min ml式中：A650 第210管所測A 650A '650第12管所測A 6500.2 第12管葡萄糖取樣量2 標準葡萄糖濃度 2mmol/L = 2科mol/ml10 反應 10mi

23、nB每管加入酶液ml數(shù)原始酶液的酶活力E =（平均E'/2）X稀釋倍數(shù)Units / ml原始組分八、計算各級分的比活力，純化倍數(shù)及回收率，并將數(shù)據(jù)列于下表：為了測定和計算下面純化表中的各項數(shù)據(jù)，對各個級分都必須取樣，每取一次樣， 對于下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。 酶的純化表如下：級 分記錄 體積(ml)校正 體積(ml)蛋白質(mg/ml)總蛋白(mg)Units/ ml總Units比活Units/ mg純化 倍數(shù)回 收 率I100nmw注:一個酶活力單位 Units,是在給定的實驗條件下，每分鐘能催化1 mole

24、蔗糖水解所需的酶量，而水解 1 mole蔗糖則生成2 moles復原糖，計算時請注意。下面是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：級分記錄體積 ml核正體積計算取樣體積 ml校正后體積 mlI1515nX (15/13.5)m55X (15/13.5) X (13.5/12)w66X (15/13.5) X (13.5/12) X (5/3.5 )四反應時間對產物形成的影響酶的動力學性質分析，是酶學研究的重要方面。下面將通過一系列實驗，研究pH、 溫度和不同的抑制劑對蔗糖酶活性的影響，測定蔗糖酶的最適pH、最適溫度、蔗糖酶催化反應的活化能，測定米氏常數(shù)Km、最大反應速度 Vmax和各

25、種抑制劑常數(shù) Ki ,由 此掌握酶動力學性質分析的一般實驗方法。本實驗是以蔗糖為底物，測定蔗糖酶與底物反應的時間進程曲線，即在酶反應的最 適條件下，每間隔一定的時間測定產物的生成量，然后以酶反應時間為橫座標，產物生 成量為縱座標，畫出酶反應的時間進程曲線，由該曲線可以看出，曲線的起始部分在某 一段時間范圍內呈直線，其斜率代表酶反應的初速度。隨著反應時間的延長，曲線斜率 不斷減小，說明反應速度逐漸降低，這可能是因為底物濃度降低和產物濃度增高而使逆 反應加強等原因所致，因此測定準確的酶活力，必須在進程曲線的初速度時間范圍內進 行，測定這一曲線和初速度的時間范圍，是酶動力學性質分析中的組成部分和實驗

26、基礎。實驗方法見“表2” ：1 .準備12支試管，按“表2”進行測定。用反應時間為 0的第一管作空白對照，此 試管要先加堿性銅試劑后加酶。 第10支試管是校正蔗糖的酸水解。 用第11管作為對照, 測定第12管葡萄糖標準的光吸收值，用以計算第29各測定管所生成復原糖的“moles”數(shù)。2 . “表2”中底物蔗糖的量為每管 0.25 moles moles的復原糖，所有的蔗糖和酶濃 度應使底物在20min內基本反應完。3 .畫出生成的復原糖的moles數(shù)即產物濃度 moles/ml與反應時間的關系曲線，即反應的時間進程曲線，求出反應的初速度。表2 反應時間對產物濃度的影響管數(shù)一1234567891

27、011120.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1/乙酸緩沖液0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/H2O葡萄糖2mmol/L堿性銅試劑1.0/由加酶開始計時蔗糖酶（1：5）0.30.30.30.30.30.30.30.30.3/反應時間 min0134812203040反應到時后立即向“212”管加入1ml堿性銅試劑中止反應堿性銅試劑/蠱薄膜，扎孔，沸水浴上煮8min后速冷磷鋁酸試劑H2O測定A650生成復原糖的moles 數(shù)五pH對蔗糖酶活動性的影響酶的生物學特性之一是它對酸堿度的敏感性，這表現(xiàn)在酶的活性和穩(wěn)定性易受環(huán)境pH的影響。pH對酶的活性

28、的影響極為顯著，通常各種酶只在一定的pH范圍內才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的 pH值下所表現(xiàn)的活性不同，其表現(xiàn)活性最高時的pH值稱為酶的最適pH。各種酶在特定條件下都有它各自的最適pH。在進行酶學研究時一般都要制作一條pH與酶活性的關系曲線，即保持其它條件恒定，在不同 pH條件下測定酶促反應速 度，以pH值為橫座標，反應速度為縱座標作圖。由此曲線，不僅可以了解反應速度隨 pH值變化的情況，而且可以求得酶的最適PH。酶溶液pH值之所以會影響酶的活性，很可能是因為它改變了酶活性部位有關基團 的解離狀態(tài)，而酶只有處于一種特殊的解離形式時才具有活性，例如：H+H +EH2+ + EH E 4 pKai

29、（有活性）pKa2酶的活性部位有關基團的解離形式如果發(fā)生變化，都將使酶轉入“無活性”狀態(tài)。 在最適pH時，酶分子上活性基團的解離狀態(tài)最適合于酶與底物的作用。此外，緩沖系 統(tǒng)的離子性質和離子強度也會對酶的催化反應產生影響。蔗糖酶有兩組離子化活性基團，它們均影響酶水解蔗糖的能力。其解離常數(shù)分別是 pKa = 7 和 pKa =3。實驗方法：1 .按下表配制12種緩沖溶液公用：將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10ml,其溶液pH值以酸度計測量值為準。溶液pH緩沖試劑體積ml緩沖試劑體積ml2 .準備二組各12支試管，第一組12支試管每支都加入上表中相應的緩沖液，然后加入一定量的蔗糖酶此時的蔗糖酶只能用

30、 H2O稀釋，酶的稀釋倍數(shù)和加入量要選擇適當，以便在當時的實驗條件下能得到的光吸收值A650。另一組12支試管也是每支都加入上表中相應的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時的空白對照 管。所有的試管都用水補足到。3 .所有的試管按一定時間間隔加入蔗糖 0.2mol/L）開始反應，反應 10min后分別加 入堿性銅試劑，用保鮮膜包住試管口并剌一小孔，在沸水浴中煮8分鐘，取出速冷，分別加入磷鋁酸試劑，反應完畢后加入水，搖勻測定A650O4 .本實驗再準備二支試管，一支用水作空白對照；另一支作葡萄糖標準管。5 .畫出不同pH下蔗糖酶活性moles/min與pH的關系曲線，注意畫出p

31、H值相同, 而離子不同的兩點，觀察不同離子對酶活性的影響。六溫度對酶活性的影響和反應活化能的測定對溫度的敏感性是酶的又一個重要特性。溫度對酶的作用具有雙重影響，一方面溫 度升高會加速酶反應速度；另一方面又會加速酶蛋白的變性速度，因此，在較低的溫度 范圍內，酶反應速度隨溫度升高而增大，但是超過一定溫度后，反應速度反而下降。酶 反應速度到達最大時的溫度稱為酶反應的最適溫度。如果保持其它反應條件恒定，在一 系列不同的溫度下測定酶活力，即可得到溫度酶活性曲線，并得到酶反應的最適溫度。最適溫度不是一個恒定的數(shù)值，它與反應條件有關。例如反應時間延長，最適溫度將降 低。大多數(shù)酶在 60c以上變性失活，個別的

32、酶可以耐100c左右的高溫。本實驗除了測定蔗糖酶催化蔗糖水解反應的熱穩(wěn)定溫度范圍與最適溫度外，還可以同時測定反應的活化能?；罨茉降?，反應速度就越快。酶作為催化劑可以大大降低反應的活化能，從而 大大增加反應的速度。本實驗除了測定蔗糖酶催化反應的活化能外，還要測定酸催化這 一反應的活化能，后者比前者要大的多，說明酸催化的能力遠不及蔗糖酶?；罨芸捎冒⒗勰釣跛狗匠淌接嬎悖篍a 1 ln kAR T式中：Ea為話化能Cal/mole，k為反應速度常數(shù) moles/min . mole，T為絕對溫度C +273，A為常數(shù)。本實驗中的速度常數(shù)“ k”，可以直接用所測定的吸光度值或反應速度v代替，進行作圖

33、和計算，請對此進行推導和論證提示：蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反應是一級反 應。實驗方法：本實驗要測定0c100C,之間16個不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應速度。 這16個溫度是冰水浴的 0C,室溫約20C,沸水浴的100c和13個水浴溫度：10C、 30 C、40 C、50 C、55 C、60C、65 C、70 C、75 C、80C、85 C、90 C、95 Co每個溫度準備2支試管，一支加酶，測酶催化，1支不加，以乙酸緩沖液作為酸，測酸催化。1 .確定酶的稀釋倍數(shù)，試管中加入的乙酸緩沖液，稀釋的酶，力口水至0.8ml加入的蔗糖開始計時，在室溫下反應10min,仍用費林試劑法進行測定，須得到

34、的吸光度，準備一個水的空白對照管0.8ml去離子水加0.2ml的蔗糖，用于測定所有的樣品管。2 .測定上列各個溫度下的反應速度，每次用2支試管，均加入乙酸緩沖液，一支加酶，另一支不加酶，均用水調至，放入水浴溫度下使反應物平衡30秒，加入蔗糖，準確反應10分鐘，立即加入堿性銅試劑中止反應，按規(guī)定進行操作，測定各管A650值，記錄每個水浴的準確溫度。3 .酶催化的各管 A650值均進行酸催化的校正。用分別畫出酶催化和酸催化的反應速 度對溫度的關系曲線和Ink1/T的關系曲線，用二條 Ink1/T關系曲線的線性部分計算兩種活化能。文獻值：蔗糖酶催化蔗糖水解的活化能為：Ea=8000Cal/mole酸

35、催化蔗糖水解白活化能為：Ea=25000Cal/mole4 .計算溫度系數(shù) Qi。，即溫度每升高10C,反應速度提高的倍數(shù)：V (T 10-k(T10)Q10=VtkT243請推導計算公式:In Q1010 EaR T (T 10)七底物濃度對催化反應速度的影響及來米氏常數(shù)Km和最大反應速度Vmax的測定根據(jù) Michaelis-Menten 方程:可以得至U Lineweaver-BurkV max SKm S雙倒數(shù)值線方程:1 Km 11V V max Si V max在1/V縱軸上的截距是1/Vmax，在1/ S橫軸上的截距是1/Km。測定Km和Vmax,特別是測定Km,是酶學研究的基本

36、內容之一，Km是酶的一個基本的特性常數(shù)，它包含著酶與底物結合和解離的性質，特別是同一種酶能夠作用于幾種 不同的底物時，米氏常數(shù)Km往往可以反映出酶與各種底物的親和力強弱，Km值越大，說明酶與底物的親和力越弱，反之，Km值越小，酶與底物的親和力越強。雙倒數(shù)作圖法應用最廣泛，其優(yōu)點是：可以精確地測定 Km和Vmax； 根據(jù)是否偏離線性很容易看出反應是否違反Michaelis-Menten動力學；可以較容易地分析各種抑制劑的影響。此作法的缺點是實驗點不均勻，V小時誤差很大。為此，建議采用一種新的Eisenthal直線作圖法，即將 Michaelis-Menten方程改變?yōu)椋篤 max VVSKm作圖

37、時，在縱軸和橫軸上截取每對實驗值：V1S1；V2S2；V3S3； 連接諸二截點，得多條直線相交于一點，由此點即可得 Km和Vmax。此作圖法的優(yōu)點是：不用作雙倒數(shù)計算；很容易識別出那些不正確的測定結果。還可以用Hanes方程進行作圖，斜率是 1/Vmax,截距分別是一 Km和K m/V max :SKmV max,6V max實驗方法：1 .本實驗和下一個實驗均采用Nelson's法分析反應產物復原糖，Nelson's法的試劑配制見本實驗最后第頁的“試劑配制方法”。因為使用了劇毒藥品，操作必須十分仔細 小心！為了掌握 Nelson's法測定的范圍，可先作一條標準曲線。按

38、下面的“表3 ”進行 實驗操作：Eisenthal直線作圖法:表3 Nelson's法測定葡萄糖的標準曲線12345678910葡萄糖（4mmol/L）果糖（4mmol/L）蔗糖（4mmol/L）H2ONelson's 試劑神試劑H2O/0.02 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30/0.20/蓋薄膜，扎孔，沸水浴中煮 20min后速冷 充分混合，除氣泡，放置 5min 旋渦混合器上充分混合每管中糖的moles 數(shù)A510A510。用A510值對復原糖的表4見下頁30秒鐘或1分鐘加酶10分鐘，然后加 1.0ml用第1管作空白對照，測定其余各管 510nm的

39、吸光度mole數(shù)作圖。2 .按下面的“表4”測定不同底物濃度對催化速度的影響。為使Km測準，必須先加蔗糖，精確移液，準確計時，每隔 一次，加酶后要搖動一下試管，每支試管都要保證準確反應Nelson's試劑，立即用保鮮膜蓋住管口，繞上橡皮筋，用針剌一小孔，幾根試管用一根 橡皮筋套住放入沸水浴，煮20分鐘后取出放入冷水中速冷。加神試劑時移液管身不要接觸試管壁。最后加7.0ml H2O以后，要充分搖勻，必要時可用一小塊保鮮膜蓋住管口, 反復倒轉試管，混勻。用塑料比色杯測定時，空白對照管溶液必須充分搖勻，徹底除去 氣泡，測A510值時要檢查參比杯內壁上是否有氣泡，假設有，須倒回原試管，再搖動除

40、 去殘余氣泡。實驗中不允許用嘴吸神試劑。實驗完畢后要注意洗手。3 .第9、10二管是先加中止反應的Nelson's試劑，后加酶，以保證加酶后不再產生任何復原糖，用以校正蔗糖試劑本身的水解和酸水解。用第9、10二管的數(shù)據(jù)畫一直線，求出其他各管的校正數(shù)據(jù)，對所測各管的A510值進行校正，然后計算每管的S, 1/S,V 和 1/V。4.畫出反應速度V與底物濃度S的關系圖，米氏曲線和1/V1/S雙倒數(shù)關系圖， 不要直接用 A510值作圖，計算Km和Vmax,并與文獻值進行比較。表4底物濃度對酶催化反應速度的影響 Km和Vmax測定表管數(shù)一123456789101112/0.02 0.03 0.

41、04 0.060.080.100.200.100.20/H2O乙酸 緩沖液0.20.2 0.20.20.20.20.20.20.20.2/Nelson's試齊/1.01.0/*蔗糖酶0.20.2 0.20.20.20.20.20.20.20.2/葡萄糖4mmol/L由加酶開始準確計時，反應10min。Nelson's試齊蓋薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷神試劑充分混合，除氣泡，放置 5minH2O旋渦混合器上充分混合A 510校正值校正后A510S11/SIV1/V* :表4中酶的稀釋倍數(shù)需仔細試測，使第 2管的A510值到達0.20.3,以便能同時適用于下面的月尿抑制實

42、驗。催化反應速度的計算：VA5io（校正）0.2 4A,510 10 2V :每ml反應液，每min消耗掉的蔗糖底物的科 mol數(shù)A'510 :第12管的吸光度值，以11管為參比X4 : 4d10 :反應 10min2 :每科mol蔗糖水解成2科mol復原糖八尿素月尿抑制蔗糖酶的實驗抑制劑與酶的活性部位結合，改變了酶活性部位的結構或性質，引起酶活力下降。根據(jù)抑制劑與酶給合的特點可分為可逆與不可逆抑制劑?？赡嬉种苿┡c酶是通過共價健結合，不能用透析等物理方法解除。這二種抑制劑類型可以通過實驗進行判斷。實驗方法為：在固定抑制濃度的情況下，用一系列不同濃度的酶與抑制劑結合，并測定反應速 度。以

43、反應速度對酶濃度作圖，根據(jù)曲線的特征即可判斷之。如以下圖所示：在可逆抑制類型中可分為競爭性抑制，非競爭性抑制和反競爭性抑制三種:1 .競爭性抑制：在競爭性抑制中，酶既可以與底物結合，又可以與抑制劑結合，但卻不能與二者同Km'增加，而最大反應速時結合，即有ES和EI,而不存在ESI。其動力學特征是表觀值度V max 不變，公式為:表觀米氏常數(shù)Km，為:已知抑制劑濃度I,由斜率計算出抑制劑常數(shù)Ki,即可算出表觀米氏常數(shù) Km'。2 .非競爭性抑制:在非競爭性抑制中，酶可以與底物和抑制劑同時結合，形成 EIS,但EIS不能進 步轉變?yōu)楫a物。其動力學特征是Vmax降低而Km不變，公式為

44、：-V maxSVI V maxV'm(1 .j(Km S)Ki表觀最大反應速度 Vmax，為：已知I,由斜率計算出 Ki,即可計算出表觀 Vmax'。實驗方法：1 .判斷可逆與不可逆抑制的實驗可選做。2 .不含抑制劑1尿的實驗，可用實驗七的數(shù)據(jù)，但必須是用同一稀釋倍數(shù)的酶， 也可以重做，注意酶濃度要大些。3 .含月尿抑制劑的實驗可參照“表4”設計實驗方案。共做三種抑制劑濃度 I的實驗， 即分別為加4mol/L的月尿0.10ml、0.20ml和，注意：此時要分別少加 H2O 0.1ml、和， 仍為12支試管，每支試管都要加月尿，第 9、10兩管仍為校正酸水解。第 11、12標準

45、管 也要加月尿，以消除月尿對顯色的影響。4 .畫出反應速度與底物濃度的關系圖，和I/VI/S關系圖，計算Km、Vmax、Ki和相應的表觀值，討論月尿對蔗糖酶活性的影響。九棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的實驗棉子糖是一種非復原性三糖，與蔗糖有相似的結構：蔗糖酶水解棉子糖，可得到雙糖密二糖和單糖果糖，果糖是復原糖。棉子糖水解的速度可以用所生成的復原糖來進行測定，由于本實驗是要測定棉子糖和果糖對蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用，為了排除果糖的干擾，就要選用一種專一地特異性測定葡 萄糖的方法，本實驗采用葡萄糖氧化酶法來測定反應中生成的葡萄糖。這一方法的反應 如下：葡萄糖氧化酶Glucose + H 2O h H2O2

46、 + Gluconic acidGlucose OxidaseH2O + Yellow pigment(Oxidized dye)黃色色素過氧化物酶(Reduced dye)鄰聯(lián)茴香胺PeroxidaseH2O2 + o Dianiside + H + 反應生成的黃色色素與葡萄糖含量成正比，用分光光度法測定420nm的吸光度值A 420。葡萄糖氧化酶試劑的配制方法為：溶液A: 40mg辣根過氧化物酶存于冰凍格溶于的磷酸鈉緩沖液，加 1500單位 葡萄糖氧化酶每組學生150ml當日新鮮配制教師配溶液B:溶解oDianisidediHCl鄰聯(lián)茴香胺染料于 100ml H2O中（先用少量冰乙酸溶解后

47、再加H2O）,置于棕色瓶冷藏。不可接觸皮膚，是致癌物教師配。使用時取“溶液 A” 100ml加“溶液B” 1ml。稱GO試齊表5葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖的標準曲線1234567葡萄糖(2mmol/L)H2OG-O試劑4.0 4.04.04.04.04.04.0混合，室溫下每管準確反應15min4N HCl0.1 0.10.10.10.10.10.1混合，至少放置5minA 420葡萄糖 moles數(shù)表6 抑制劑棉子糖與果糖對酶活性的影響12345678910（空白）（校正）H2O乙酸緩沖液*蔗糖酶G O試劑4N HCl0.1/室溫下準確反應10min ,立即放入沸水浴加熱2min以中止反應，再

48、立即放入冰浴速冷。4.0卜混合均勻，室溫下準確反應15min。0.1 混合均勻，室溫放置5min。A420* :試測酶濃度時，0.1ml酶溶液應使第8管得到1.0左右的吸光度。實驗方法：1 .測定葡萄糖的標準曲線準備7支試管按上面“表 5 ”中的步驟進行測定，用 A420和葡萄糖的 moles數(shù)作 圖。2 .棉子糖和果糖抑制作用的測定1準備26支試管，試管110用上面“表6”所列的方法進行測定，第 1管作空 白對照，第9、10兩管用作校正蔗糖的水解。2試管1118放入18管同樣量的緩沖液和蔗糖，但還要加的棉子糖，然后用H2O補加到，加同樣的酶溶液開始計時，詳見“表 6”，第11管為這一組的空白

49、對照。3試管1926進行同樣的操作，只是用果糖代替棉子糖。4用9、10管的數(shù)據(jù)修正各管的A42。，計算各底物濃度S和反應速度Vmoles/nim，畫出三條 VS關系曲線，計算 1/V和1/S,畫出Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)關系圖。5根據(jù)Lineweaver-Burk關系圖評價抑制方式，并計算Km、Vmax由斜率計算棉子糖和果糖的Ki,然后分別計算表觀 Km'。注：假設室溫較低，本實驗可用恒溫水浴恒溫于25c或30 CK附錄:試劑配制方法：1. 1M乙酸：取冰乙酸17M加H2O稀釋至100ml。2. 0.5M NaOH ：稱 2g NaOH 溶于 100 ml H 2O。3. 0.5M HCl: 取 4.2 ml 濃 HCl 12M 加入H2O 中，稀釋到100 ml 注意必須是酸