同時(shí)測(cè)量陰離子,陽(yáng)離子方法驗(yàn)證

1、同時(shí)測(cè)量陰離子，陽(yáng)離子：方法驗(yàn)證摘要：常規(guī)方法同時(shí)檢測(cè)陰陽(yáng)離子采用離子色譜進(jìn)行分析，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且無(wú)法測(cè)定未知物質(zhì)。本文利用新型電噴霧式檢測(cè)器與離子色譜相連同時(shí)分析陰陽(yáng)離子，并對(duì)分析方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，不但靈敏度可低至毫微克水平，而且方法可靠，重現(xiàn)性好，較之單獨(dú)的離子色譜更是高效、快捷，適于推廣。 關(guān)鍵詞：ICS-5000，Corona CAD，醋酸銨，陰離子，陽(yáng)離子 1 前言 同時(shí)測(cè)定陰離子和陽(yáng)離子通常用離子色譜法通過(guò)一個(gè)電導(dǎo)檢測(cè)器（ICCD）進(jìn)行分析。這種技術(shù)往往需要明確的被分析物，而且陽(yáng)離子和陰離子，必須分別的使用特定的平臺(tái)測(cè)定。一個(gè)創(chuàng)新的方法是利用電噴霧使檢測(cè)器（Corona C

2、AD.）與離子色譜ICS-5000相連并選用高分子兩性HILIC柱，可將含量低至毫微克級(jí)的陰離子、陽(yáng)離子在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)測(cè)定且具有重現(xiàn)性。這種方法允許通過(guò)梯度優(yōu)化檢測(cè)條件，使更多的分析物可在同一套儀器平臺(tái)上測(cè)定，包括：陰離子，陽(yáng)離子，氨基酸，有機(jī)酸，和很多藥物活性物質(zhì)（API）。為廣大使用者提供了一種更快，更經(jīng)濟(jì)的分析方法，優(yōu)化簡(jiǎn)單，包括所有相關(guān)元件和流動(dòng)相組成只需輕微的調(diào)整即可。CAD的靈敏度可檢測(cè)出混合物中含有的0.1的離子，而大多數(shù)的混合物是在藥物研發(fā)過(guò)程中需要根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步調(diào)整的，因此快速提供準(zhǔn)確結(jié)果十分必要。本應(yīng)用注解描述了常規(guī)的梯度法和驗(yàn)證結(jié)果的具體細(xì)節(jié)。 圖1.覆蓋8個(gè)不同濃

3、度（800ppb100ppm;.8 - 1000 ng o.c.）的銨離子或醋酸鹽中離子。2 材料與方法 樣品制備與分析 下列六個(gè)鹽都是預(yù)先備好的去離子水溶解的濃度為10mg/mL：硝酸銨，氯化銨，硫酸銨，磷酸銨，醋酸鈉，醋酸鉀。取這些樣品的部分混合，然后用80/20乙腈/水稀釋到大約以下的鹽離子濃度:100，50，25，12.5，6.3，3.2，1.6，0.8g/mL。額外的樣品制備，是用來(lái)測(cè)試的每一個(gè)目標(biāo)離子的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。化合物和進(jìn)樣濃度列于表1。 這8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和精確稱(chēng)量樣品被轉(zhuǎn)移到安捷倫的聚丙烯瓶。標(biāo)樣4（.12.5mg/mL）在檢測(cè)過(guò)程中進(jìn)樣22次，來(lái)檢查重現(xiàn)性和中間分析準(zhǔn)確性

4、。在檢測(cè)過(guò)程中流動(dòng)相分別準(zhǔn)備三次來(lái)檢查的方法的適用性。 方法參數(shù) 儀器：離子色譜ICS-5000 色譜柱：Sequant ZIC. - pHILIC; 4.6 x 150毫米，5m 柱溫：30 進(jìn)樣體積：10l 流速：0.5 ml/min 流動(dòng)相A：100 mM的醋酸銨（pH4.6），甲醇，異丙醇，乙腈（15 v:5 v:20 v:60 v） 流動(dòng)相B：30mM醋酸銨（pH4.6），甲醇，異丙醇，乙腈（50 v:5 v:20 v:25 v） 梯度：表2 Corona：100pA范圍，無(wú)過(guò)濾器 樣本瓶：聚丙烯或認(rèn)證的硼硅酸鹽材質(zhì) 表1.方法的準(zhǔn)確性，反離子測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性 表2.梯度參數(shù) 3結(jié)果

5、與討論 在圖1中，在8個(gè)不同濃度點(diǎn)重復(fù)同一實(shí)驗(yàn)。得到的數(shù)據(jù)符合二階多項(xiàng)式的擬合并在上柱81000ng符合線性擬合分別如圖2A和2B所示。這種分析的準(zhǔn)確性通過(guò)對(duì)有無(wú)機(jī)鹽或包含反離子的有機(jī)化合物的比較得以驗(yàn)證。表2列出的是被測(cè)化合物和離子重復(fù)檢測(cè)的百分濃度。對(duì)所有的離子實(shí)驗(yàn)值始終在5的理論值以?xún)?nèi)以適合標(biāo)準(zhǔn)化線性如圖2A所示。對(duì)磷酸鹽離子的檢測(cè)限大于8 ng。因此，磷酸鹽只有6個(gè)高濃度點(diǎn)（3.2 - 100g/mL）可以用于濃度曲線。其他離子的所有8個(gè)點(diǎn)都可用于制濃度曲線。對(duì)6種離子進(jìn)行線性回歸分析，每個(gè)單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都大于0.9998，符合2階多項(xiàng)式擬合的系數(shù)大于0.993。每一個(gè)離子的

6、檢測(cè)限，低毫微克水平的上柱測(cè)試，列于表3中。 重復(fù)性和中間分析準(zhǔn)確性通過(guò)一段時(shí)間對(duì)標(biāo)樣4（.12.5g/mL每種鹽離子濃度）的峰面積和保留時(shí)間的檢查得以檢測(cè)。第一天和第二天標(biāo)樣4均進(jìn)樣5次。再為第4天及第7天的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1瓶新標(biāo)樣，在這兩天分別重復(fù)進(jìn)樣6次。六個(gè)離子的峰面積重現(xiàn)性以及保留時(shí)間重現(xiàn)性通過(guò)這22數(shù)據(jù)來(lái)檢測(cè)。第7天的實(shí)驗(yàn)也采用了新的流動(dòng)相，這會(huì)引起保留時(shí)間數(shù)據(jù)的小漂移。跨日和日間重復(fù)性結(jié)果分別列于表3和表4。 結(jié)論 本研究收集的數(shù)據(jù)表明，使用Corona檢測(cè)器分析離子準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好水平可低至毫微克。所有主要部件通過(guò)氯離子，硫酸根，鈉，鉀進(jìn)行了測(cè)試驗(yàn)證。該分析不是一個(gè)包括了所有必要的穩(wěn)定性級(jí)別的完整的驗(yàn)證根據(jù)美國(guó)FDA Q7A。但它確實(shí)證明了檢測(cè)器和方法的準(zhǔn)確性，線性，檢測(cè)限以及中間精密度。除了方法的靈活性這種驗(yàn)證分析方法的能力使電噴霧成為一種新型的可替代許多傳統(tǒng)檢測(cè)器的實(shí)用性技術(shù)。Corona CAD是一個(gè)強(qiáng)有力的可以替代ICCD的同時(shí)分析陽(yáng)離子和陰離子的檢測(cè)器。 表3.方法靈敏度（色譜柱上樣質(zhì)量，而不是鹽注射濃度）表4.離子保留時(shí)間精確度，4個(gè)濃度經(jīng)過(guò)7天表5.峰面積精密度測(cè)試，離子測(cè)試(125ng o.c.) 圖2A銨離子或醋酸鹽離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線（三次進(jìn)樣平均值，每