非小細(xì)胞肺癌中P53表達(dá)的不同亞細(xì)胞定位及功能意義的研究

1、    非小細(xì)胞肺癌中P53表達(dá)的不同亞細(xì)胞 定位及功能意義的研究        摘要目的：探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中不同亞細(xì)胞定位P53蛋白及其可能的功能意義。方法：以免疫組化及流式細(xì)胞分析術(shù)研究了43例NSCLC病人腫瘤組織P53表達(dá)定位與G1/S檢查點功能及DNA含量的關(guān)系。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)P53蛋白不同的亞細(xì)胞定位與病人的病程密切相關(guān)，同時，在P53核表達(dá)定位的病人腫瘤組織細(xì)胞S期比例明顯增多而G0G1期比例明顯較胞漿表達(dá)病人減少，G2M期比例及DNA指數(shù)在

2、兩組間無明顯差異。結(jié)論：不同亞細(xì)胞定位的P53蛋白具有不同的G1/S檢查點調(diào)節(jié)功能，胞漿P53蛋白仍有部分G1/S檢查點調(diào)控功能，因此出現(xiàn)較少的SPF及較多的G0G1細(xì)胞，代表了惡性度較低的細(xì)胞亞群；而核表達(dá)陽性P53蛋白具有更差的G1/S檢查點調(diào)控功能，代表了惡性度較高的腫瘤亞群，這與腫瘤進(jìn)展可能有關(guān)。主題詞癌，非小細(xì)胞肺； 蛋白質(zhì)P53； 病人中分類號R734.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1000-4718(2000)04-0327-03 P53 overexpression in different subcellular location in non small cell lung ca

3、ncerYang Qin(Department of Pathophysiology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004， China)AbstractAIM:Nuclear P53 localization was considered to be proof of mutation, cytoplasmic staining has also been signalled. In this study, special attention has paid to protein subcelluler localization. A diffe

4、rent functional meaning may attributed to tumor biological characteristic and evolution. METHODS: Immunohistochemical approach and flow cytometry were used to explored the relationship between P53 overexpression pattern (nuclear and cytoplasmic) and G1/S checkpoint function of P53 protein in cell cy

5、cle. RESULTS: Two patterns of P53 overexpression are related to disease stage significantly. S-phase fraction (SPF) was higher and G0-G1 phase fraction was lower in P53 nuclear pattern than cytoplasmic (SPF, 42.42±5.45/14.12±4.42, G0-G1：53.04±6.14/75.56±4.46, respectively P0.05).

6、 No difference was found in G2-M phase fraction and DNA index between two patterns. CONCLUSION: Most of the cells showing cytoplasmic P53 overexpression pattern are properly arrested in G/S checking point, which may represent an early tumor cell population with low grade of neoplastic development. I

7、n contrast, inactivated product detectable at nuclear level possible carry a mutated P53 associated with tumor progression. The mechanism of P53 cytoplasmic location is not clear.MeSH Carcinoma, non-small-cell lung; Protein P53; Patients突變的抑癌基因P53似乎是目前為止在肺癌中最常發(fā)生的基因異常。其他學(xué)者及我們對非小細(xì)胞肺癌（non small cell lu

8、ng cancer, NSCLC）的研究都發(fā)現(xiàn)大約50NSCLC出現(xiàn)P53表達(dá)的改變13。近來有研究發(fā)現(xiàn)用免疫組化方法檢出的P53表達(dá)異常有兩種不同的亞細(xì)胞定位，胞漿表達(dá)陽性（胞漿定位，C）及核表達(dá)陽性（核定位，N）4。我們的研究發(fā)現(xiàn)這種不同的亞細(xì)胞定位與NSCLC的病理分期密切相關(guān)，這兩種不同的亞細(xì)胞定位是否有P53蛋白功能改變的提示意義？為此，我們以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析了同一NSCLC組織中細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞成份，如S期比例（S-phase-fraction, SPF），G0-G1期比例（G0/G1-phase fraction）及G2-M期比例（G2/M-phase fracti

9、on），觀察不同亞細(xì)胞定位的P53蛋白與細(xì)胞G1/S檢查點功能的關(guān)系，以探討這種不同亞細(xì)胞定位的P53蛋白功能狀況。材料和方法一、病人的臨床病理資料用免疫組化的方法及流式細(xì)胞術(shù)分析研究42例手術(shù)切除的NSCLC病人的腫瘤組織，其中男性35例、女性7例，年齡4676歲。腫瘤組織診斷及分類按國際衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后病理學(xué)分期按美國癌癥協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)，在42例NSCLC中，鱗癌14例、腺癌20例、其他NSCLC（包括腺鱗癌及大細(xì)胞癌等）8例。、期病人26例（占61.9）、期病人16例（38.1）。二、P53蛋白的免疫組化測定標(biāo)本術(shù)后立即-80冰凍保存，5 m冰凍切片，丙酮固定10 min,0.3%

10、過氧化物/甲醇處理30 min,與1 BSA共育1 h后，同第一抗體（DO-7，11200磷酸緩沖液稀釋，Dako產(chǎn)品）室溫下共育2 h。免疫反應(yīng)用Vectastain Elite試劑盒（Vectastain ABC kit, Vector Lab.）。陽性對照用已知P53陽性的肺癌標(biāo)本，陰性對照用無關(guān)抗體或PBS處理的同一組織切片。鏡下觀察P53染色陽性細(xì)胞百分率，P53表達(dá)的陽性率范圍為：10%50的腫瘤細(xì)胞染色。據(jù)染色部位的不同，將這些細(xì)胞分為核染色陽性及胞漿染色陽性兩種形式。三、流式細(xì)胞術(shù)分析42例手術(shù)切除的NSCLC組織，機(jī)械性剪切制備細(xì)胞懸液，50目尼龍網(wǎng)過濾，PBS洗滌，用0.5

11、 mg/mL RNAsae在37下處理30 min。Propidium-Iodide(50mg/mL)4染色12 h，Coulter EPICS Elite (Sony, Japan)分析儀分析。每個樣品測定20 000個細(xì)胞，細(xì)胞周期分析用Multicycle 253 Software 處理，SPF、G0G1及G2M期比例以百分率計算。四、統(tǒng)計處理P53表達(dá)陽性及表達(dá)的不同亞細(xì)胞定位與病人病理參數(shù)的比較用Peason 2檢驗。對不同P53表達(dá)定位的SPF、G0G1及G2M細(xì)胞的比例比較行t檢驗。結(jié)果一、P53表達(dá)的不同亞細(xì)胞定位與病人臨床資料P53表達(dá)陽性可在免疫組化染色的組織切片中觀察到不

12、同程度的細(xì)胞核或胞漿染色，42例NSCLC中20例（47.6%）觀察到明顯的P53表達(dá)陽性（核表達(dá)陽性8例，胞漿表達(dá)12例）。在表達(dá)陽性的病例中鱗癌4例，腺癌11例，其他NSCLC 5例。P53表達(dá)陽性與病人的年齡、性別、組織學(xué)類型及分化程度無關(guān)，但是P53表達(dá)陽性的不同亞細(xì)胞定位（核表達(dá)陽性與胞漿表達(dá)陽性）與病人的病理分期有關(guān)（P0.05），核表達(dá)陽性多見于、期病人組織而胞漿表達(dá)陽性多見于、期病人組織。二、腫瘤細(xì)胞SPF及G0G1期、G2M期比例與不同亞細(xì)胞表達(dá)的P53的關(guān)系以FCM分析上述P53表達(dá)陽性的NSCLC不同細(xì)胞周期細(xì)胞成份發(fā)現(xiàn)，與P53胞漿表達(dá)陽性組比較，P53核表達(dá)陽性的腫瘤

13、SPF明顯增高（P0.05）而G0G1明顯減少（P0.01），G2M期比例在兩組間無明顯差異（P0.05），DNA指數(shù)在兩組未發(fā)現(xiàn)明顯不同。表1P53不同亞細(xì)胞定位與細(xì)胞周期各階段細(xì)胞成份的分析Tab 1Analysis of P53 overexpression pattern withcycly phase (<"01.jpg (732 字節(jié))" src="/med/cano/201003/20100309194018464.jpg" 15 17>±s，n=42)P53 negativen=22P53 positive（C）n=

14、12（N）n=8G0-G186.84±1.9475.56±4.4853.04±6.14*SPF5.70±1.8414.12±4.4242.42±5.45*G1-M phase8.11±2.5310.42±3.474.62±3.46DNA index1.27±0.441.43±0.611.62±0.76     * P0.05，(N) vs(C) 討論P(yáng)53在細(xì)胞生長及腫瘤形成中有重要作用。P53在DNA損傷后作用于細(xì)胞周期的G1/S檢查

15、點，誘導(dǎo)細(xì)胞G1期滯留或凋亡，由此保持基因穩(wěn)定性，它生長抑制作用的機(jī)制在于其對決定生長抑制的基因如waf-1等的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用。P53的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)是其N端的轉(zhuǎn)錄區(qū)、中部序列特異性的DNA結(jié)合區(qū)及C端的核定位區(qū)。因此，P53是一種核磷酸蛋白，核定位對它在G1后期的生長抑制活動是必要的。核定位信號直接的點突變可導(dǎo)致P53細(xì)胞胞漿滯留并完全破壞它的轉(zhuǎn)錄抑制活性5。P53調(diào)節(jié)抑制通路功能的紊亂與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)2，3。事實上，P53功能失活在人類惡性腫瘤中很常見，至少50的腫瘤都發(fā)生P53突變。最近我們對P53在NSCLC中表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，P53在NSCLC的表達(dá)有兩種不同的亞細(xì)胞定位，除通常所

16、見的細(xì)胞核表達(dá)陽性外，我們還觀察到為數(shù)不少的胞漿表達(dá)陽性，類似的結(jié)果在以往對P53在肺癌或其他腫瘤表達(dá)的研究中也有報道1，3，4，6，但未曾引起重視，關(guān)于其功能狀態(tài)的研究未見報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)P53在NSCLC中的這兩種不同的定位分布與病人的病理分期有關(guān)，核表達(dá)陽性多見于、期病人而胞漿表達(dá)多見于、期病人。由此，我們質(zhì)疑這種不同位置表達(dá)的P53蛋白其功能是否有所不同。有研究表明，P53突變細(xì)胞最直接、最重要的后果是G1/S檢查點控制功能的喪失7。為研究這兩種不同亞細(xì)胞定位的功能意義，我們以FCM研究了同一組腫瘤組織各細(xì)胞周期細(xì)胞比例以探討對細(xì)胞周期G1/S檢查點的調(diào)控功能。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)P

17、53核表達(dá)陽性的細(xì)胞G1/S檢查點功能明顯喪失，大量細(xì)胞由此進(jìn)入S期，SPF明顯增多，而G0G1比例明顯減少。與核表達(dá)陽性不同，P53胞漿表達(dá)陽性的細(xì)胞G1/S檢查點功能尚存，仍有部分的調(diào)控作用，仍能控制大量細(xì)胞停滯在G0G1期而不進(jìn)入S期，所以SPF較核表達(dá)陽性明顯為少（P0.01），但較P53表達(dá)陰性組已明顯增高，而G0G1期比例明顯較核表達(dá)陽性組為多（P0.01）。這結(jié)果表明：在NSCLC中不同亞細(xì)胞定位的P53蛋白其功能狀態(tài)不同。胞漿表達(dá)的P53蛋白尚有部分的G1/S控制功能，而核表達(dá)的P53蛋白幾乎喪失這一功能。P53蛋白這種不同的亞細(xì)胞定位及不同的功能狀態(tài)與我們前面觀察到的這種不同

18、亞細(xì)胞定位與病人病理分期有關(guān)的結(jié)果吻合，證實我們的推測：P53胞漿表達(dá)陽性代表惡性度較低的腫瘤亞群，在這些細(xì)胞中，P53腫瘤抑制基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖尚有一定的抑制調(diào)控能力；而P53核表達(dá)陽性代表了惡性度較高的腫瘤亞群，這些細(xì)胞的P53腫瘤抑制基因已發(fā)生突變不再具有或僅具有很弱的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。Stanton等8對神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）及Moll等9人對乳腺癌細(xì)胞胞漿表達(dá)的P53蛋白功能的研究結(jié)果與我們在NSCLC的研究結(jié)果類似。這些結(jié)果均提示：在腫瘤細(xì)胞中，還存在一種與P53功能失活無關(guān)的P53蛋白胞漿滯留。P53蛋白在腫瘤細(xì)胞核積累通常認(rèn)為是P53基因突變的結(jié)果，但非突變的P53蛋白積累

19、還可能與以下幾種機(jī)制有關(guān)：（1）P53蛋白降解酶系統(tǒng)失活，（2）P53蛋白由于與細(xì)胞癌蛋白如mdm-2或DNA病毒蛋白ST-40V等結(jié)合而形成復(fù)合物，因此穩(wěn)定性增加，（3）DNA損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后修飾而延長半衰期，（4）P53基因在細(xì)胞其他轉(zhuǎn)錄物調(diào)節(jié)下發(fā)生表達(dá)的改變，如過度表達(dá)等。最近Moll等9對DNA損傷后胞漿P53蛋白G1/S檢查點功能改變的研究結(jié)果提示：在NB細(xì)胞中，這種胞漿定位的P53蛋白有不同程度的P53對G1/S檢查點調(diào)節(jié)功能的損傷，而且這種尚存P53功能的胞漿P53蛋白停滯機(jī)制與大分子蛋白的聚集有關(guān)，后者參與P53蛋白轉(zhuǎn)錄后的修飾而干擾了P53蛋白降解及P53由胞漿進(jìn)入核的過程。

20、我們在非小細(xì)胞肺癌中觀察到的這種胞漿P53停滯與上述哪種機(jī)制有關(guān)，尚需進(jìn)一步的探討?；鹳Y助 省科委基金及國家留學(xué)基金委基金資助楊勤（貴陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,貴州貴陽550004）參考文獻(xiàn)1Elizabeth B, Sylvie G, Denis, et al. Immunohistochemical study of P53 in human lung carcinomas J. Am J Path, 1993, 143:199213.2Vincenzo E, Alfonso B, Antonio DL, et al. Prognostic value of P53 in non-sma

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