青藤堿對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)液及血清白細(xì)胞介素1β含量的影響

1、青藤堿對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)液及血清白細(xì)胞介素1含量的影響         09-08-14 11:30:00     作者：楊惠琴, 陳禮榮    編輯：studa20【摘要】  目的：探討關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射青藤堿對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)液及血清中白細(xì)胞介素1（interleukin1, IL1）含量的影響。方法：除正常對(duì)照組（n=4）外，36只兔采用左后肢膝關(guān)節(jié)伸直位石膏管型制動(dòng)法建立兔骨關(guān)節(jié)炎模型。造模6周后青藤堿組兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射青藤

2、堿，1次/周，連續(xù)5周，透明質(zhì)酸組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸，模型組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水，正常組不治療。分別于治療前及治療后采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)關(guān)節(jié)液及血清IL1含量，并對(duì)軟骨組織進(jìn)行Mankin評(píng)分。結(jié)果：與模型組比較，青藤堿組骨性關(guān)節(jié)炎兔血清及關(guān)節(jié)液中IL1含量下降（P<0.01），且青藤堿組低于透明質(zhì)酸組（P<0.05）。青藤堿組的軟骨Mankin評(píng)分明顯低于透明質(zhì)酸組（P<0.05）。結(jié)論：青藤堿可能通過(guò)抑制關(guān)節(jié)液及血清中IL1表達(dá)降低兔骨性關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)退變程度。 【關(guān)鍵詞】  骨性關(guān)節(jié)炎; 青藤堿; 白細(xì)胞介素1; 兔Methods: Degenera

3、tive osteoarthritis in the knee joint of left posterior limb was induced in 36 rabbits by full extension using plaster cast for 6 weeks. Then the rabbits were randomly divided into untreated group, hyaluronic acid group and sinomenine group. Another 4 normal rabbits were selected as normal control g

4、roup. Rabbits in the sinomenine group and the hyaluronic acid group received intraarticular injections of sinomenine and hyaluronic acid once a week for 5 weeks, respectively. The content of IL1 in synovial fluid and serum were measured before and after treatment by enzymelinked immunosorbent assay.

5、 The pathological changes of cartilaginous tissue were analyzed by using Mankin's score.Results: Compared with those in the untreated group, synovial fluid and serum IL1 contents in the sinomenine group and the hyaluronic acid group were significantly decreased (P<0.01). And the synovial flui

6、d and serum IL1 contents in the sinomenine group were lower than those in the hyaluronic acid group (P<0.05). The mean Mankin's score of cartilage in the sinomenine group was significantly lower than that in hyaluronic acid group (P<0.05).Conclusion: Sinomenine may reduce the degree of art

7、icular degeneration in rabbit with OA through decreasing the content of IL1 in synovial fluid and serum.Keywords: osteoarthritis; sinomenine; interleukin1; rabbits骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA）是以關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍形成骨質(zhì)增生為病理特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病，是影響人類健康最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾患之一。青藤堿是一種從中藥青風(fēng)藤的莖和根中提取的生物堿單體。研究表明青藤堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用1。目前對(duì)于青藤堿的研

8、究主要集中在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效及機(jī)制方面，而對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的治療則少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)研究青藤堿對(duì)關(guān)節(jié)液及血清白細(xì)胞介素1（interleukin1, IL1）的表達(dá)及對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)的影響，初步探討青藤堿治療骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  健康56月齡日本大耳白兔40只，雄性，體質(zhì)量2.22.6 kg（平均2.5 kg），由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(鄂)20050016。1.2  實(shí)驗(yàn)藥物、主要試劑及儀器  IL1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme l

9、inked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒，上海西唐生物科技有限公司生產(chǎn)；番紅O/固綠(safranin' O/fast green, S/F)染色劑，成都科比特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；青藤堿注射劑，50 mg/支（2 ml），湖南正青集團(tuán)公司生產(chǎn)，批號(hào)為050912032；透明質(zhì)酸（施沛特）注射劑20 mg/支（2 ml），由山東正大福瑞達(dá)制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)為051006031。美國(guó)Thereto公司酶標(biāo)儀（Wellwash 4MK2型），德國(guó)HERAUS公司臺(tái)式離心機(jī)（B4IBR4I型），上海一恒科技有限公司電熱恒溫水箱（DK600A型）。1. 3

10、60; 動(dòng)物模型的制備  按Videman2的管型石膏伸直位制動(dòng)法建立骨性關(guān)節(jié)炎模型。取36只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行造模，將其左后肢腹股溝以下1.5 cm至踝關(guān)節(jié)下3 cm（趾端）用石膏管型固定于伸直位，踝關(guān)節(jié)背屈3040度，制動(dòng)6周。造模期間采用一籠一兔喂養(yǎng)，每天檢查石膏固定的情況，并及時(shí)進(jìn)行修復(fù)。6周后去除石膏。1.4  實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法  制動(dòng)6周后，將骨性關(guān)節(jié)炎模型兔隨機(jī)分為模型組、透明質(zhì)酸組和青藤堿組，每組12只，另取4只正常實(shí)驗(yàn)兔作為正常組。給藥方法為關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，注射針頭進(jìn)針約0.40.7 cm，當(dāng)感到阻力消失且有突破感時(shí)表示已進(jìn)入關(guān)節(jié)腔。藥物根據(jù)成人用藥劑量

11、（青藤堿和透明質(zhì)酸均為2 ml/次）按MeehRubner公式3計(jì)算人兔等效劑量。青藤堿組給予青藤堿注射劑0.2 ml/次（相當(dāng)于2 mg/kg），透明質(zhì)酸組給予透明質(zhì)酸注射劑0.2 ml/次（相當(dāng)于0.8 mg/kg），模型組關(guān)節(jié)腔注入0.2 ml生理鹽水，1次/周，連續(xù)5周。正常組不給予任何處理。全部動(dòng)物于末次給藥后1周處死并取材。1.5  IL1含量檢測(cè)  所有實(shí)驗(yàn)兔分別于造模成功后及治療5周后，膝關(guān)節(jié)注入無(wú)菌生理鹽水1.0 ml，在關(guān)節(jié)內(nèi)混勻后抽取，離心后每膝獲取200 l關(guān)節(jié)液，20 保存。同時(shí)留取耳緣靜脈血0.5 ml，并分離血清，20 冰箱內(nèi)保存。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)取

12、血清及關(guān)節(jié)液各100 l進(jìn)行檢測(cè)。IL1含量檢測(cè)采用ELISA雙抗體夾心法，嚴(yán)格按照藥盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（optical density, OD）值，并計(jì)算IL1含量。1.6  關(guān)節(jié)軟骨病理觀察及Mankin評(píng)分  取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)股骨內(nèi)髁軟骨，10%中性甲醛固定48 h，5%硝酸脫鈣，常規(guī)乙醇逐級(jí)脫水，石蠟包埋。將股骨內(nèi)髁標(biāo)本行矢狀面平行切片，切片厚約7 m，每個(gè)標(biāo)本貼片兩張：一張常規(guī)HE染色，一張行S/F染色。行S/F染色時(shí)將切片常規(guī)脫蠟、水化，魏格特氏鐵蘇木素溶液（Weigerts iron hematoxylin）染色5 min，蒸

13、餾水流水沖洗10 min，酸性酒精分色15 s，蒸餾水流水沖洗3 min，0.02%固綠染色5 min，1%乙酸洗15 min，0.1%番紅O染色5 min，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。采用Mankin評(píng)分方法4，確定關(guān)節(jié)軟骨的受損程度。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  本研究采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，行多組間兩兩比較，所得數(shù)據(jù)以x±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。2  結(jié)果2.1  血清和關(guān)節(jié)液IL1含量  造模結(jié)束后，模型組大鼠關(guān)節(jié)液及血清中IL1含量與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。治療后，與模型組比較，青藤堿組與透明質(zhì)酸組大鼠關(guān)節(jié)液及血清中IL1含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與透明質(zhì)酸組血清及關(guān)節(jié)炎中IL1含量比較，青藤堿組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。表1  各組血清及關(guān)節(jié)液IL1含量變化（略）Table 1  Changes of IL1 contents in synovial fluid and serum in four groups*P<0.01, vs untreate