高效液相色譜法同時測定枳殼飲片中4種黃酮類化合物的含量

1、高效液相色譜法同時測定枳殼飲片中4種黃酮類化合物的含量張宏武1，封宇飛2，鄒忠梅1（1 中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學藥用植物研究所，北京100094；2 衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學部臨床藥理室，北京 100730）摘要 目的：建立高效液相色譜法測定枳殼飲片中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。方法：采用Sunfire C18色譜柱（150mm×4.6mm，5m），以乙腈-0.1磷酸溶液（2080）為流動相，流速為1mL·min-1，檢測波長為283nm，柱溫為30。結(jié)果：柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分別在0.074123.7g·mL-1，0.60999.

2、0g·mL-1，0.072120.3g·mL-1和0.59982.0g·mL-1范圍內(nèi)線性良好，其平均回收率分別為96.6%，96.1%，96.0%和97.2%。結(jié)論：該方法簡便、快速、準確、重復(fù)性好，可用于枳殼中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的同時測定。關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；枳殼；柚皮蕓香苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷中圖分類號 R927.2 文獻標識碼 A 文章編號 1003-3734Simultaneous determination of four flavonoids in Citrus aurantium Lby HPLCZHANG Hong-w

3、u1，F(xiàn)ENG Yu-fei2，ZOU Zhong-mei1(1 Institute of Medicinal Plant Department，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100094，China；2 Clinical Pharmacology Base of Beijing Hospital，Beijing 100730，China)Abstract Objective：To establish a HPLC method for simultaneous dete

4、rmination of narirutin， naringin，hesperidin and neohesperidin in Citrus aurantium L. Methods：The HPLC analysis was performed on a Sunfire C18（150mm×4.6mm，5m）column. The column temperature was set at 30. A mixture of acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution（2080）was used as the mobile

5、phase with the flow rate at 1 mLmin-1. The detection wavelength was set at 283 nm. Results：Narirutin，naringin，hesperidin and neohesperidin showed good linearity in the ranges of 0.074123.7gmL-1，0.60999.0gmL-1，0.072120.3gmL-1，and 0.59982.0gmL-1 with average recoveries of 96.6%，96.1%，96.0% and 97.2%，r

6、espectively. Conclusion：The method is simple，rapid，accurate and reproducible for simultaneous determination of narirutin，naringin，hesperidin and neohesperidin in Citrus aurantium L. Key words HPLC；Citrus aurantium L.；narirutin；naringin；hesperidin；neohesperidin枳殼為蕓香科Rulaceae植物酸橙Citrus aurantium L及其栽培

7、變種的干燥未成熟果實，是臨床上常用的理氣藥之一。味苦、辛、酸、溫。功能理氣寬中，行滯消脹。用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停，胃下垂，脫肛，子宮脫垂1。黃酮類成分柚皮苷、新橙皮苷、柚皮蕓香苷、橙皮苷為枳殼的主要活性成分。2005年版中華人民共和國藥典一部收載了高效液相法測定枳殼中柚皮苷的含量1，枳殼飲片及制劑中橙皮苷、新橙皮苷的含量測定方法也有報道24，但枳殼中柚皮蕓香苷的含量測定未見報道。中藥為多成分多靶點發(fā)揮療效，基于采用多指標成分定量分析能更加全面反映枳殼飲片質(zhì)量的考慮，本研究在等度洗脫的條件下，采用HPLC法建立了同時測定枳殼水提物中4種黃酮類化合物含量的方法，方法簡便、快速、

8、準確、重復(fù)性好。儀器與試藥Waters 2690高效液相色譜儀（996PDA二極管陣列檢測器，515泵，Empower工作站，美國Waters公司）；AT201型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Millipore超純水機（美國Millipore公司）。柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品均為自制，經(jīng)光譜分析和HPLC面積歸一化法測定含量分別為97.4%，96.8%，97.8%，95.8%；28批麩炒枳殼樣品和9批枳殼生品樣品購于全國12個不同省、市藥店及不同的產(chǎn)地；所有樣品由中國醫(yī)科院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定，均為蕓香科植物Rulaceae植物酸橙Cit

9、rus aurantium L及其栽培變種的干燥未成熟果實。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。方法與結(jié)果1 色譜條件色譜柱：Sunfire C18柱（150mm×4.6mm，5m）；流動相為乙腈-0.1磷酸溶液（2080）；流速為1mL·min-1；檢測波長為283nm；柱溫為30；進樣量為10L。在該色譜條件下，柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷均能達到基線分離，見圖1。 對照品 枳殼樣品1 柚皮蕓香苷，2 柚皮苷，3 橙皮苷，4 新橙皮苷圖1 高效液相色譜圖2 對照品溶液及供試品溶液的制備2.1 對照品溶液 分別精密稱取柚皮蕓香苷對照品約1.00mg、柚皮苷對照品約1

10、0.00mg、橙皮苷對照品約1.00mg、新橙皮苷約10.00mg置于同一10mL量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品原溶液。2.2 供試品溶液 稱取枳殼飲片約10g，粉碎，過60目篩，精密稱取1.0g，置圓底燒瓶中，加20mL水，水浴加熱回流提取1h，放冷，濾過，藥渣加入20mL水同樣操作提取2次，每次1h，過濾，合并過濾液，減壓濃縮，移至10mL量瓶，加水定容，為供試品原液，再精密量取供試品原液1mL置10mL量瓶中，加水稀釋并定容，0.45m微孔濾膜濾過，即得。3 方法學考察3.1 線性關(guān)系及檢出限考察 精密稱取含有柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品原溶液適量，用

11、流動相依次稀釋成柚皮蕓香苷：0.074，0.74，7.4，74，123.7g·mL-1；柚皮苷：0.60，6.0，60.0，600.0，999.0g·mL-1；橙皮苷：0.072，0.72，7.2，120.3g·mL-1；新橙皮苷：0.59，5.9，59.0，590.0，982.0g·mL-1系列濃度，按“1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。根據(jù)對照品濃度（C，g·mL-1）和對照品峰面積（As）進行線性回歸。柚皮蕓香苷在0.074123.7g·mL-1；柚皮苷在0.60999.0g·mL-1；橙皮苷在0.072120.3

12、g·mL-1；新橙皮苷在0.59982.0 g·mL-1內(nèi)呈良好的線性(n=5)，線性回歸方程分別為：柚皮蕓香苷：Y=345857X-10722，r=0.9999；柚皮苷：Y=4×106X-315034，r=0.9996；橙皮苷：Y=523735X-69214，r=0.9998；新橙皮苷：Y=4×106X-339362，r=0.9998。柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷最低檢測濃度分別為（S/N3）：3.70，3.00，3.60，2.95 ng·mL-1。3.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，按“1”項色譜條件日內(nèi)連續(xù)重復(fù)進樣5次，并連續(xù)

13、測定5d，每天連續(xù)重復(fù)進樣5次，記錄峰面積，柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷日內(nèi)峰面積的RSD分別為0.18%，0.20%，0.28%，0.31%；日間峰面積的RSD分別為0.29%，0.12%，0.44%，0.39%。3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批藥材粉末5份，按照“1”項色譜條件重復(fù)進樣5次，記錄峰面積，計算柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，其平均含量分別為5.55，36.76，2.67，26.02mg·g-1；RSD分別為0.56%，0.11%，1.2%，1.6%。3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在0，4，8，12，16，20，24h分別進樣測定，按“1

14、”項色譜條件進樣，記錄峰面積，結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.21%，0.40%，0.23%，1.0%。3.5 回收率試驗 精取同一已知含量的枳殼飲片約1.0g置4個置圓底燒瓶中，分別加入柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品原溶液0.0，0.4，0.6，0.8mL，按照“供試品的制備”項下方法制備，取續(xù)濾液按“1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，由測得量與加入量計算回收率，結(jié)果低、中、高3種濃度的柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率（n=3）分別為96.6%，96.1%，96.0%，97.2%；RSD分別為0.

15、26%，0.51%，1.9%，1.7%。4 樣品含量測定對市售28批麩炒枳殼飲片和9批枳殼生品按照“供試品溶液的配制”項下的方法制備供試品溶液，按“1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算枳殼飲片中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，結(jié)果見表1和2。結(jié)果表明，市售大部分麩炒枳殼飲片和枳殼生品中以柚皮苷和新橙皮苷為主，除廣州仁和堂藥店的生品中未檢測到柚皮苷外，其他樣品均有柚皮苷，但含量從0.2149.5mg·g-1，相差200多倍；新橙皮苷含量最高可達到32.31 mg·g-1，但有7份麩炒枳殼和1份枳殼生品未檢測到。同樣，柚皮蕓香苷和橙皮苷的含量差異也很大，分別為0.0

16、09.42 mg·g-1和0.0027.82 mg·g-1，4種黃酮總量差異也很大，8.0282.73 mg·g-1，相差10倍之多。但市售麩炒和生品之間4種黃酮總量沒有很大差異。表1 28種麩炒枳殼中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量測定結(jié)果 n=3編號來源柚皮蕓香苷/mg·g-1柚皮苷/mg·g-1橙皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1總黃酮/mg·g-11遼寧朝陽大藥房7.432.403.451.6714.952河北安新安康大藥房5.5330.284.9716.3857.163河北安新萬通藥業(yè)4.3

17、922.874.4712.644.334遼寧朝陽成大方圓藥店8.4529.543.8922.3564.235遼寧朝陽康寧大藥房4.340.502.110.097.0426天津南開同輝大藥房6.4534.498.5227.6877.147廣州市統(tǒng)一藥店4.2440.051.5823.0868.958天津津東大藥房026.490026.499重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院9.4220.405.9413.248.9610重慶市益壽堂藥店3.8821.873.270.1329.1511重慶市桐君閣大藥店059.940059.9412天津市敬一堂藥店4.4540.261.3121.9767.9913廣州保利祝

18、福你大藥店5.360.463.5909.4114廣州柏康連鎖藥店4.433.034.431.0812.9715上海雷允上西區(qū)分公司5.3439.032.9522.9470.2616浙江杭州中藥飲片廠4.5026.834.2420.7956.3617上海養(yǎng)合堂5.070.382.5708.0218廣州大森林公司前進分店5.360.213.820.159.5419哈爾濱敬修堂藥店0.0439.100.62039.7620哈爾濱福生堂藥店6.270.232.1708.67321北京松蘭飲片廠5.5036.432.6324.4569.0122北京宏生堂藥店6.7134.795.4316.8563.78

19、23遼陽紅太陽藥業(yè)040.860040.8624沈陽四方藥大藥房1.1336.0927.820.3865.4225沈陽東北大藥房5.5713.164.5110.7133.9526廣州仁和堂藥店4.710.283.280.208.4727北京同仁堂2.5332.712.2721.2158.7228四川省樂山建為縣人民醫(yī)院1.1028.831.5532.2163.69表2 9批枳殼生品中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量測定結(jié)果 n=3編號來源柚皮蕓香苷/mg·g-1柚皮苷/mg·g-1橙皮苷/mg·g-1新橙皮苷/mg·g-1總黃酮/mg·

20、g-11廣州仁和堂藥店6.1503.8009.952安徽新興中藥材飲片公司3.3726.022.1321.5553.073江西3.3823.021.7820.1448.324湖北5.4142.801.9225.1075.235湖北7.510.292.290.0810.176沈陽四方藥大藥房4.930.271.980.077.257遼陽大藥房5.4449.52.7425.0582.738廣州大森林公司前進分店5.7218.93.9510.5339.19四川省樂山建為縣便民藥店3.1828.982.4926.0160.66討 論1 檢測波長的選擇將含有柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對照品混合溶液進樣分離后，利用DAD檢測器在200400 nm掃描其吸收光譜，4種成分均在283 nm處有最大吸收，因此選擇其為測定波長。2 樣品提取方式的考察實驗比較了95%乙醇回流提取、超聲20min，水溶液回