22局部用藥的毒性研究

1、第二十二章第二十二章 局部用藥的毒性研究局部用藥的毒性研究案例案例 痤瘡痤瘡 是一種毛囊皮脂炎癥，多發(fā)于青年男女面部、胸是一種毛囊皮脂炎癥，多發(fā)于青年男女面部、胸部等皮脂分泌旺盛的區(qū)域，持續(xù)時間長，且易反復(fù)發(fā)部等皮脂分泌旺盛的區(qū)域，持續(xù)時間長，且易反復(fù)發(fā)作。作。 克林霉素克林霉素-過氧苯甲酰凝膠過氧苯甲酰凝膠 是由克林霉素磷酸脂與過氧苯甲酰制成的復(fù)方制是由克林霉素磷酸脂與過氧苯甲酰制成的復(fù)方制劑，臨床用于痤瘡治療。要求觀察其對皮膚的劑，臨床用于痤瘡治療。要求觀察其對皮膚的刺激性刺激性與與過敏反應(yīng)過敏反應(yīng)。 局部用藥的毒性試驗是根據(jù)局部用藥部局部用藥的毒性試驗是根據(jù)局部用藥部 位的解剖和生理特點

2、設(shè)計的位的解剖和生理特點設(shè)計的。 涂劑、擦劑涂劑、擦劑 皮膚用藥皮膚用藥 膏劑、凝膠劑膏劑、凝膠劑 其他透皮吸收制劑其他透皮吸收制劑常用局部用藥制劑常用局部用藥制劑 滴眼劑、滴鼻劑滴眼劑、滴鼻劑 噴霧劑噴霧劑 直腸和陰道制劑直腸和陰道制劑 肌內(nèi)注射肌內(nèi)注射 第一節(jié) 皮膚用藥的毒性研究皮膚組織結(jié)構(gòu) 表皮表皮 真皮真皮 皮下組織皮下組織 皮膚覆蓋全身。皮膚覆蓋全身。 表皮較薄，厚為表皮較薄，厚為0.1-0.2mm0.1-0.2mm。 角質(zhì)層角質(zhì)層 表皮表皮 顆粒層顆粒層 生發(fā)層生發(fā)層 真皮依附于皮下組織，厚約真皮依附于皮下組織，厚約2mm2mm。 膠原膠原 真皮真皮 彈性硬蛋白彈性硬蛋白 纖維母細(xì)

3、胞纖維母細(xì)胞一、化學(xué)物質(zhì)對皮膚毒性作用的類型一、化學(xué)物質(zhì)對皮膚毒性作用的類型 根據(jù)性質(zhì)不同，由藥根據(jù)性質(zhì)不同，由藥物引起的皮膚損害包括物引起的皮膚損害包括原原發(fā)性刺激炎癥反應(yīng)發(fā)性刺激炎癥反應(yīng)和和致敏致敏反應(yīng)反應(yīng)，偶然也可引起皮膚，偶然也可引起皮膚癌。癌。（一）皮膚原發(fā)性刺激（一）皮膚原發(fā)性刺激 原發(fā)性刺激原發(fā)性刺激藥物直接作用于皮膚引起的病藥物直接作用于皮膚引起的病理性反應(yīng)。理性反應(yīng)。 紅斑、水腫紅斑、水腫 原發(fā)性刺激的表現(xiàn)原發(fā)性刺激的表現(xiàn) 水皰瘡水皰瘡 潰瘍潰瘍 強堿強堿 脂溶性溶劑脂溶性溶劑l 原發(fā)性刺激機理原發(fā)性刺激機理 鎘酸鹽鎘酸鹽 銀、汞、砷等金屬鹽銀、汞、砷等金屬鹽 特征：特征：

4、有明確的毒理學(xué)量有明確的毒理學(xué)量-效關(guān)系。效關(guān)系。 首次接觸即可產(chǎn)生某種特征。首次接觸即可產(chǎn)生某種特征。（二）皮膚致敏（二）皮膚致敏 皮膚致敏為變態(tài)反應(yīng)，皮膚致敏為變態(tài)反應(yīng)， 包括：包括：藥物致敏藥物致敏和和光敏反應(yīng)光敏反應(yīng)。 作用機制作用機制 藥物與蛋白以共價鍵結(jié)合，具用免疫原性。藥物與蛋白以共價鍵結(jié)合，具用免疫原性。 藥物在光的作用下，形成半抗原性物質(zhì)。藥物在光的作用下，形成半抗原性物質(zhì)。 特征特征 沒有明確的毒理學(xué)量沒有明確的毒理學(xué)量-效關(guān)系。效關(guān)系。 再次接觸該藥物才能激發(fā)特定癥狀。再次接觸該藥物才能激發(fā)特定癥狀。（三）皮膚致癌（三）皮膚致癌 有機大分子化合物有機大分子化合物-多環(huán)芳烴

5、類多環(huán)芳烴類 金屬鹽金屬鹽-無機砷鹽無機砷鹽（一）皮膚用藥急性毒性實驗 1. 定義： 指動物完整或破損皮膚一次性接觸受試物后在短期內(nèi)出現(xiàn)的毒性反應(yīng)實驗。 2.受試物： 使用臨床制劑，如臨床制劑濃度無法滿足劑量要求，受試物為粉末狀的用適宜基質(zhì)（如凡士林、羊毛脂等）溶解混勻。 3.實驗動物及實驗條件 每組動物數(shù)：每組動物數(shù)： 一般選白色家兔、小型豬4-6只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半； 動物體重：動物體重： 家兔2-3kg，豚鼠200-300g，大鼠200-250g，小型豬30- 40kg。 飲食、攝水：飲食、攝水： 自由飲食、攝水。 動物房溫濕度：動物房溫濕度： 家兔、豚鼠及小型豬控制在18-2

6、6；大鼠控制在20-25，相對濕度均為40%-70%；換氣次數(shù)為10-20次/min；12h明暗交替光照。 4.劑量設(shè)計 至少應(yīng)設(shè)三個劑量組，另設(shè)賦形劑對照組，必要時設(shè)空白對照組。 如受試物在擬用臨床給藥時有可能與破損皮膚接觸，則應(yīng)另設(shè)破損皮膚組。 5.實驗操作 給藥前24h對給藥區(qū)（通常在背部）進(jìn)行脫毛處理，給藥時將受試物均勻涂于動物脫毛區(qū)，液體制劑，應(yīng)將受試物涂于敷料上，再貼于脫毛或破損皮膚區(qū)，用半封閉的外罩固定敷料。 涂敷24h后，除去敷料，用溫水或適宜的溶劑除去殘留的受試物和賦形劑。 觀察期：觀察期： 連續(xù)觀察14d，觀察1-2次/天。也可根據(jù)出現(xiàn)毒性反應(yīng)的情況適當(dāng)延長。觀察指標(biāo)：觀察

7、指標(biāo)： 給藥前后7d、14d稱體重，觀察給藥后動物的全身反應(yīng)：皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、行為、自主活動、肌張力等，有無顫抖、震顫、抽搐、流涎、腹瀉、少動、精神萎靡不振、昏迷等毒性反應(yīng)癥狀。若有動物死亡應(yīng)立即進(jìn)行尸檢，有明顯異常時，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。6.觀察指標(biāo)7.結(jié)果評價 對觀察到的陽性癥狀結(jié)合大體解剖或病理組織學(xué)結(jié)果進(jìn)行綜合分析，與對照組比較，對動物的毒性反應(yīng)及死亡原因作出明確判斷。 病理組病理組對照組對照組（二）皮膚給藥長期毒性實驗（二）皮膚給藥長期毒性實驗1.定義 指動物完整或破損皮膚長期反復(fù)接觸受試物后出現(xiàn)的毒性反應(yīng)及其可逆程度實驗。2.受試物 與“皮膚給藥急性毒性試驗”基本相

8、同。3.實驗動物及條件 與“皮膚給藥急性毒性試驗”一致。 4.劑量設(shè)計 至少應(yīng)設(shè)三個劑量組. (可設(shè)賦形劑對照組，必要時設(shè)空白對照組。) 高劑量：原則上應(yīng)使動物產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)，甚至出現(xiàn)個別動物死亡； 低劑量：原則上應(yīng)高于動物藥效學(xué)實驗的等效劑量，并不使動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)； 中劑量：動物可出現(xiàn)輕度毒性反應(yīng)。5.給藥期限藥物臨床療程藥物臨床療程皮膚給藥長期毒性實皮膚給藥長期毒性實驗給藥期限驗給藥期限可以支持的臨床研究階段可以支持的臨床研究階段單次給藥2周期，期（及生產(chǎn)）2周1個月期，期（及生產(chǎn)）2周1個月1個月期3個月期（及生產(chǎn)）3個月3個月期6個月期（及生產(chǎn)）6個月6個月期，期（及生產(chǎn)）6個月

9、6個月期，期（及生產(chǎn)） 6.給藥頻率 給藥期限3個月，原則上應(yīng)每天給藥； 給藥期限3個月，每周至少應(yīng)給藥6d； 也可根據(jù)臨床給藥頻率給藥。 7.恢復(fù)期限 給藥結(jié)束后保留部分動物，繼續(xù)觀察其可能出現(xiàn)的延遲性毒性反應(yīng)，并了解毒性反應(yīng)的可逆程度。 根據(jù)受試物的藥代動力學(xué)特點、靶器官或靶組織的毒性反應(yīng)和實際恢復(fù)情況確定恢復(fù)期的長短。 8.實驗操作 首次給藥前24h對給藥區(qū)在背部進(jìn)行脫毛處理。每天給藥1次，每次至少接觸6h。保證受試物與給藥部位具有良好接觸并避免動物食入藥物?？捎眉啿嫉葻o刺激性輔料包裹或給動物穿上特制的通透性好的外套。 9.觀察指標(biāo) 除增加給藥部位皮膚及其周圍組織乃至全身皮膚變化和皮膚病

10、理學(xué)檢查外，其余指標(biāo)與長期毒性實驗要求一樣。 10.結(jié)果評價 局部毒性反應(yīng)的結(jié)果評價與長毒實驗要求一樣，應(yīng)根據(jù)各檢測指標(biāo)及病理組織學(xué)檢查結(jié)果綜合分析。除此以外還應(yīng)注意評價給藥局部及其周圍組織的毒性反應(yīng)。（三）皮膚刺激性實驗（三）皮膚刺激性實驗1.1.定義：定義： 皮膚刺激性：皮膚刺激性：指經(jīng)皮膚給藥后，在皮膚上產(chǎn)生的可逆性炎性病變。 （若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為（若給藥部位產(chǎn)生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。）腐蝕性。） 皮膚刺激性實驗：皮膚刺激性實驗：是觀察動物的皮膚接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出等局部反應(yīng)。 2.2.受試物受試物 應(yīng)采用與臨床應(yīng)用制劑一致，符合臨床用質(zhì)

11、量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的受試物進(jìn)行實驗，同時注明其名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、賦形劑、保存條件及配制方法等，其中賦形劑和雜質(zhì)等的名稱和量應(yīng)盡可能明確，并附有研制單位的自檢報告。所用賦形劑應(yīng)該標(biāo)明批號、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，并符合實驗要求。 3.3.實驗動物實驗動物 多種哺乳動物可以選擇，一般首選白色家兔，每組動物數(shù)48只，雌、雄各半。也可以選用其他種屬的動物 (如小型豬等) ,選擇家兔和小型豬以外的動物應(yīng)闡明合理性。4.4.實驗操作實驗操作 設(shè)賦形劑對照，采用同體左右側(cè)自身對比法。 試驗前24h對給藥區(qū)進(jìn)行脫毛處理。去毛范圍各3cm3cm。(給藥前應(yīng)檢查去毛皮膚是否因去毛而受損傷，有損傷的皮膚不宜進(jìn)行實驗

12、。) 進(jìn)行破損皮膚的刺激性研究時，在用藥部位用砂紙磨或劃“井”字并以滲血為度。 4.實驗操作實驗操作 受試物藥量一般是固體或半固體0.5g，液體0.5ml，直接涂布于一側(cè)已去毛的皮膚上，然后用兩層紗布(2.5cm 2.5cm)和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定； 另一側(cè)涂布賦形劑做對照。貼敷時間至少4h。貼敷結(jié)束后，除去受試物并用溫水或無刺激性溶劑清潔給藥部位。 注：多次給藥皮膚刺激性實驗應(yīng)連續(xù)在同一部位給藥，每次給藥時間相同，貼敷期限一般不超過4周。 刺激反應(yīng) 分值 刺激反應(yīng) 分值紅斑 無紅斑 0 輕度紅斑（勉強可見） 1 中度紅斑（明顯可見） 2 重度紅斑 3 紫紅色

13、紅斑到輕度焦痂形成 4水腫 無水腫 0 輕度水腫（勉強可見） 1 中度水腫（明顯隆起） 2 重度水腫（皮膚隆起1mm，輪廓清楚） 3 嚴(yán)重水腫（皮膚隆起1mm以上并有擴大）4 總分值 85.觀察指標(biāo)觀察指標(biāo) 在自然光線或全光譜燈光下觀察皮膚反應(yīng)。按表給出的評分標(biāo)準(zhǔn)對皮膚紅斑和水腫進(jìn)行評分。6.結(jié)果評價結(jié)果評價 單次給藥實驗： 計算每一觀察時間點各組受試物及賦形劑皮膚反應(yīng)積分的平均分值，按表進(jìn)行刺激強度評價。 多次給藥實驗： 首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內(nèi)每天每只動物積分均值，按表進(jìn)行刺激強度評價。 分 值 評 價 分 值 評 價00.49 無刺激性0.52.99 輕度刺

14、激性3.05.99 中度刺激性6.08.0 強刺激性（四）（四） 皮膚吸收試驗皮膚吸收試驗（1 1）整體皮膚吸收試驗）整體皮膚吸收試驗 化合物經(jīng)皮滲透的量同皮膚微灌流量直接相關(guān)，化合物經(jīng)皮滲透的量同皮膚微灌流量直接相關(guān)，通過測量與皮膚灌流量相關(guān)的電壓，測算出化學(xué)經(jīng)通過測量與皮膚灌流量相關(guān)的電壓，測算出化學(xué)經(jīng)皮吸收速率。皮吸收速率。 1）LDV法 用用643.8nm氦氦-氖激光，照射血管中流動中的紅細(xì)氖激光，照射血管中流動中的紅細(xì)胞，測量用藥前后變化，測定出皮膚吸收速度。胞，測量用藥前后變化，測定出皮膚吸收速度。PPG法 LED射出的射出的800-940nm紅外線照射，收集反射光轉(zhuǎn)變紅外線照射，

15、收集反射光轉(zhuǎn)變成電壓波譜，通過電壓波譜變化，計算皮膚吸收量的成電壓波譜，通過電壓波譜變化，計算皮膚吸收量的大小大小。（2 2）離體皮膚吸收試驗）離體皮膚吸收試驗l 靜態(tài)滲透裝置靜態(tài)滲透裝置 上室防藥劑，下室接受液，下室中間方皮膚上室防藥劑，下室接受液，下室中間方皮膚并密封，藥劑放于皮膚之上，每隔一定時間后，并密封，藥劑放于皮膚之上，每隔一定時間后，測定接受液，計算皮膚滲透率。測定接受液，計算皮膚滲透率。流動滲透裝置流動滲透裝置 上述方法的改進(jìn)，接受液為血漿或白蛋白，上述方法的改進(jìn)，接受液為血漿或白蛋白，以以5ml/小時的速度灌流，測定不同時間灌流液小時的速度灌流，測定不同時間灌流液的藥量。以次

16、測定皮膚的透過率。的藥量。以次測定皮膚的透過率。（五）（五） 皮膚過敏試驗皮膚過敏試驗?zāi)康哪康?通過動物皮膚重復(fù)接觸受試物，觀察機體免疫系統(tǒng)反映通過動物皮膚重復(fù)接觸受試物，觀察機體免疫系統(tǒng)反映在皮膚上的表現(xiàn)。在皮膚上的表現(xiàn)。方法方法 實驗材料實驗材料 1）動物）動物-豚鼠豚鼠 2）受試藥物）受試藥物-膏劑、液體不稀釋直接涂敷膏劑、液體不稀釋直接涂敷 3）陽性致敏物：）陽性致敏物： 2,4-二硝基氯代苯二硝基氯代苯 1%-致敏濃度致敏濃度 0.1%-激發(fā)濃度激發(fā)濃度 試驗方法試驗方法 1）試驗分組）試驗分組 隨機分成三組：隨機分成三組： 給藥組、賦形劑組、陽性對照組給藥組、賦形劑組、陽性對照組

17、2）致敏接觸）致敏接觸 0.1-0.2ml(g)涂于脫毛區(qū)，接觸涂于脫毛區(qū)，接觸6小時，小時， 第第7天和天和14天亦同樣方法重復(fù)。天亦同樣方法重復(fù)。 3）激發(fā)接觸）激發(fā)接觸 末次給藥后第末次給藥后第14天，激發(fā)給藥，天，激發(fā)給藥，6、24、48和和72小時觀察小時觀察皮膚過敏情況。皮膚過敏情況。結(jié)果判斷與評價結(jié)果判斷與評價皮膚過敏反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)刺激反應(yīng) 程度 分值 刺激反應(yīng) 程度 分值紅斑形成 水腫形成無紅斑 0 無水腫 0輕度紅斑 1 輕度水腫 1中度紅斑 2 中度水腫 2重度紅斑 3 重度水腫 3水腫性紅斑 4最高總分值 7致敏率分類過敏反應(yīng)強度 致敏率%弱致敏性 0-10輕度致敏性 10

18、-30中度致敏性 30-60高度致敏性 60-80極度致敏性 80-100 紅斑形成總分+水腫形成總分 反應(yīng)平均值= 合計動物總數(shù)（六）（六） 皮膚光敏試驗皮膚光敏試驗?zāi)康哪康?觀察受試物接觸皮膚后遇光照否有光敏反應(yīng)觀察受試物接觸皮膚后遇光照否有光敏反應(yīng)試驗方法試驗方法 1）光敏反應(yīng)試驗）光敏反應(yīng)試驗 評價標(biāo)準(zhǔn)評價標(biāo)準(zhǔn) 2）光毒性試驗）光毒性試驗 評價標(biāo)準(zhǔn)評價標(biāo)準(zhǔn)第二節(jié)第二節(jié) 眼睛用藥刺激性試驗眼睛用藥刺激性試驗眼睛的結(jié)構(gòu) 角膜結(jié)膜炎 炎癥 角膜表面水腫 上皮脫落 刺激作用 結(jié)膜充血、水腫 灼痛、流淚、畏光 慢性結(jié)膜炎、瞼腺炎、分泌物增多 試驗?zāi)康?角膜渾濁刺激性試驗 試驗方法 虹膜 結(jié)果與評

19、價 結(jié)膜 水腫 分泌物目的目的 觀察動物眼睛接觸受試物所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)觀察動物眼睛接觸受試物所產(chǎn)生的刺激反應(yīng)方法方法 家兔，原液（原膏）加入眼睛腫家兔，原液（原膏）加入眼睛腫0.1ml (0.1g)， 閉合閉合5-10分鐘。分鐘。 6、24、48和和72小時至小時至7天眼刺激情況。天眼刺激情況。結(jié)果與評價結(jié)果與評價眼刺激反應(yīng)評分眼刺激反應(yīng) 分值角膜渾濁 0-4虹膜 0-2結(jié)膜 0-3水腫 0-4分泌物 0-3總分 16眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)眼刺激性評價標(biāo)準(zhǔn)刺激程度 積分無刺激性 0-3輕度刺激性 4-8中度刺激性 9-12重度刺激性 13-16第三節(jié)第三節(jié) 肌內(nèi)注射用藥局部刺激性試驗肌內(nèi)注射用藥局部

20、刺激性試驗?zāi)康哪康?肌內(nèi)注射后藥物對肌肉的刺激性反應(yīng)情況。肌內(nèi)注射后藥物對肌肉的刺激性反應(yīng)情況。方法方法 家兔家兔6只，一側(cè)骨四頭肌注射供試物，只，一側(cè)骨四頭肌注射供試物， 另一側(cè)注射生理鹽水另一側(cè)注射生理鹽水1-2ml作為對照，作為對照， 48小時處死動物，取骨四頭肌縱向剖開，小時處死動物，取骨四頭肌縱向剖開， 肉眼觀察，觀察注射部位刺激情況，肉眼觀察，觀察注射部位刺激情況， 必要時作組織病理學(xué)檢查。必要時作組織病理學(xué)檢查。家兔股四頭肌肌肉組織結(jié)果與評價結(jié)果與評價肌內(nèi)注射刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)級數(shù) 刺激反應(yīng) 0 給藥部位無明顯反應(yīng) 1 給藥部位輕度充血，直徑0.5cm以下 2 給藥部位中度充血

21、，直徑1.0cm以下 3 給藥部位中度充血，紅腫，肌肉有變性 4 出現(xiàn)肌肉褐色變性，壞死0.5cm以下 5 肌肉嚴(yán)重變性，出現(xiàn)大片壞死超過超過2 2認(rèn)為不符合規(guī)定，不可進(jìn)行肌內(nèi)注射認(rèn)為不符合規(guī)定，不可進(jìn)行肌內(nèi)注射第四節(jié) 靜脈給藥局部刺激性試驗 見第二十章：全身用藥毒性試驗中見第二十章：全身用藥毒性試驗中- -血管刺激性試驗血管刺激性試驗第五節(jié) 滴鼻劑和吸入劑的毒性試驗一、滴鼻劑和吸入劑急性毒性試驗一、滴鼻劑和吸入劑急性毒性試驗l 目的目的 觀察受試物一次滴入或吸入后對動物產(chǎn)生的毒性觀察受試物一次滴入或吸入后對動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)或死亡情況。反應(yīng)或死亡情況。 方法方法 3個劑量組，組距個劑量組，組

22、距0.65-0.85, 滴入或吸入；滴入或吸入； 4小時后即可以及小時后即可以及7-14天觀察動物。天觀察動物。結(jié)果評價結(jié)果評價二、滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗二、滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗l 目的目的 觀察受試物一次滴入或吸入后對動物產(chǎn)生的刺激觀察受試物一次滴入或吸入后對動物產(chǎn)生的刺激反應(yīng)。反應(yīng)。 方法方法 將受試物滴入或噴霧于動物，將受試物滴入或噴霧于動物，24小時后處死動物，小時后處死動物，觀察有無充血、紅腫等。觀察有無充血、紅腫等。結(jié)果評價結(jié)果評價第六節(jié) 應(yīng)用于直腸、陰道制劑的毒性試驗一、直腸、陰道用藥急性毒性試驗一、直腸、陰道用藥急性毒性試驗l 目的目的 受試物對動物直腸或陰道產(chǎn)生的毒性反應(yīng)或死亡受試物對動物直腸或陰道產(chǎn)生的毒性反應(yīng)或死亡情況。情況。方法方法 栓劑、膏劑或液體等，將受試物輕置入直腸或陰栓劑、膏劑或液體等，將受試物輕置入直腸或陰道內(nèi)。道內(nèi)。 至少接觸至少接觸4小時，觀察即可以及小時，觀察即可以及7-14天的情況。天的情況。結(jié)果評價結(jié)果評價二、直腸、陰道