綠色熒光蛋白和成肌調(diào)節(jié)因子在骨髓基質(zhì)干細胞中的共表達(1)

1、    綠色熒光蛋白和成肌調(diào)節(jié)因子在骨髓基質(zhì)干細胞中的共表達(1)    】 目的：研究重組腺病毒（Ad）對骨髓基質(zhì)干細胞（MSCs）的轉(zhuǎn)染，以及綠色熒光蛋白（GFP）和成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表達. 方法：用差速貼壁法體外培養(yǎng)大鼠MSCs，并用流式細胞儀（FCM）檢測其表面標志；對構(gòu)建有綠色熒光蛋白的重組腺病毒（AdGFP）進行擴增和鑒定，并轉(zhuǎn)染MSCs；用RTPCR檢測MyoD和Myogenin在轉(zhuǎn)染后MSCs中的表達；將MSCs與C2C12成肌細胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)前者的分化，并用免疫熒

2、光檢測MyoD的表達. 結(jié)果：FCM檢測證實，在MSCs的表面標志中CD11b和CD45陰性，而CD29和CD44陽性；隨著AdGFP感染復(fù)數(shù)（MOI）的增加，轉(zhuǎn)染效率也相應(yīng)提高，但在MOI大于100后，MSCs開始出現(xiàn)病變；RTPCR結(jié)果提示MyoD和Myogenin在轉(zhuǎn)染后的MSCs中有表達；免疫熒光檢測證實誘導(dǎo)后的MSCs可以表達MyoD蛋白. 結(jié)論：MSCs可以被AdGFP有效轉(zhuǎn)染而表達GFP；同時內(nèi)源性成肌調(diào)節(jié)因子的激活，可以促進MSCs的成肌分化.【關(guān)鍵詞】 基質(zhì)干細胞；腺病毒；綠色熒光蛋白；C2C12；MyoD；Myogenin0引言骨髓基質(zhì)干細胞（mesenchymal ste

3、m cells, MSCs）具有向成骨、脂肪、神經(jīng)以及肌肉等多種類型細胞分化的潛能，其易于分離和擴增的特性，使其成為細胞治療的一種很有前景的治療手段1-3. 為促使MSCs更好地定向分化，對其進行外源性基因修飾和/或內(nèi)源性基因的激活，成為目前亟待解決的問題. 我們通過構(gòu)建有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的型重組腺病毒（AdGFP）轉(zhuǎn)染大鼠的MSCs，并與C2C12成肌細胞共培養(yǎng)，通過激活內(nèi)源性成肌調(diào)節(jié)因子，啟動MSCs的成肌分化.1材料和方法1.1材料DMEM和1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、新生牛血清（Hayclon

4、e公司）、FITC熒光標記小鼠抗大鼠抗體（PharMingen and Serotec公司）、人胚腎293細胞和AdGFP（中山大學(xué)黃文林教授惠贈）、C2C12細胞（中山大學(xué)潘秋輝博士惠贈）、兔抗MyoD多克隆抗體（SantaCruz公司）、山羊抗兔cy3 IgG二抗（chemicon公司）. 健康雄性SD大鼠，清潔級，質(zhì)量5070 g，購于中山大學(xué)實驗動物中心.1.2方法1.2.1大鼠骨髓MSCs的體外分離培養(yǎng)及鑒定將SD大鼠引頸處死后于無菌條件下分離出股骨和脛骨，用注射器沖出骨髓后，再經(jīng)吹打制成單細胞懸液. 離心后棄上清，用加有胎牛血清（FCS）的DMEM重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)23

5、d后換液. 約12 wk，細胞生長融合至80%時，用胰酶消化后傳代培養(yǎng)至P4代以后生長均一，可用于實驗. 常規(guī)消化MSCs，PBS洗3次，加入飽和濃度FITC熒光標記的小鼠抗大鼠CD11b, CD29, CD44和CD45抗體，室溫下避光孵育30 min，再以PBS清洗，多聚甲醛固定，流式細胞儀（FCM）檢測MSCs的表面抗原.1.2.2293細胞的培養(yǎng)、AdGFP的擴增、純化、滴度的測定及鑒定將293細胞培養(yǎng)在含100 mL/L新生牛血清的1640中培養(yǎng)約48 h，細胞生長至80%融合時傳代培養(yǎng). 當細胞生長至90%融合時，可用于AdGFP的擴增. 棄去培養(yǎng)基，加入AdGFP，再加含50 m

6、L/L新生牛血清和35 g/L精氨酸的1640培養(yǎng)3648 h. 當細胞出現(xiàn)病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）時，連同培養(yǎng)液一同收集在離心管中，室溫1000 r/min，離心5 min，棄上清，加細胞裂解液，吹打均勻后凍存，在下次應(yīng)用前，應(yīng)于-80/37反復(fù)凍融3次，然后3600 r/min離心30 min，取上清接種至293細胞. 用CsCl2梯度離心法純化病毒，用TCID50檢測方法測定純化后的病毒滴度約為8×109國際單位（IU）. 取病變后293細胞的裂解上清，按照酚氯仿抽提方法提取病毒DNA，進行病毒基因組E2b區(qū)的PCR檢測. 正義引物為5TCGTTT

7、CTCAGCAGCTGTTG3， 反義引物為5CATCTGAACTCAAAGCGTGG3， 94預(yù)變性5 min，94變性1 min53退火1 min72延伸1 min，35個循環(huán)后，72延伸10 min.1.2.3AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs將MSC平均接種于六孔板中（2×105/孔），加無血清的DMEM，約23 h后細胞完全貼壁，按照感染復(fù)數(shù)（multiple of infection, MOI）分別為10，20，50，100，150，200，300，400和500，依次接種相應(yīng)劑量的AdGFP，2 h后，加含有FCS的DMEM孵育24 h. 消化并離心后再用無血清的DMEM重懸，用F

8、CM檢測轉(zhuǎn)染效率. 檢測所用激發(fā)光為488 nm，接收光為530 nm，用Cellquest軟件進行數(shù)據(jù)獲取與分析. 以未轉(zhuǎn)染的細胞作為陰性對照，使陰性對照區(qū)細胞數(shù)不超過0.1%.            作者：李美山，張成，陳松林，于美娟，張雅妮，王淑輝，熊符 【關(guān)鍵詞】腺病毒Coexpression of both green fluoresce         本篇論文是由3COME文檔頻道的

9、網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。1.2.4轉(zhuǎn)染前后MSCs的RNA提取及RTPCR反應(yīng)取轉(zhuǎn)染前后的MSCs提取總RNA. 按照試劑盒操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄，分光光度計測定cDNA的濃度和純度后，再進行PCR擴增. MyoD的正義引物為5CAACTGCTCTGATGGCATGATGG3，反義引物為5TGTTCTGCATCGCTTGAGGATGTC3；Myogenin的正義引物為5ACTACCCACCGTCCATTCAC3， 反義引物為5TCGGGGCACTCACTGTCTCT3；

10、actin的正義引物為5AGGCATCCTGACCCTGAAGTAC3，反義引物為5TCTTCATGAGGTAGTCTGTCAG3，反應(yīng)條件為94預(yù)變性3 min，94變性40 s56退火40 s72延伸1 min，35個循環(huán)后，72延伸10 min.1.2.5轉(zhuǎn)染GFP的MSCs與C2C12成肌細胞共培養(yǎng)后的免疫熒光檢測將轉(zhuǎn)染GFP后的MSCs與C2C12細胞按101混合，接種于培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)（密度為104/cm2），48 h后檢測MyoD的表達. 先后用多聚甲醛固定的Triton破膜， H2O2和山羊血清分別封閉，加兔抗MyoD（1100）于4過夜，山羊抗兔cy3（1200）孵育，DAP

11、I（15000）復(fù)染后觀察.2結(jié)果2.1MSCs的傳代、擴增、純化及表面標志測定骨髓細胞懸液在接種24 h后開始貼壁，呈散在圓形分布；72 h后可見球形和梭形細胞生長. 培養(yǎng)57 d可見明顯分裂增殖的細胞，形成形態(tài)均一的細胞增殖集落. 培養(yǎng)至10 d左右，90%以上的細胞趨于融合，傳代后68 h以內(nèi)細胞基本貼壁. 24 h后開始增殖，細胞集落增多，呈“旋渦狀”生長. 3 d后可傳代，連續(xù)傳45代后趨于純化（圖1）. FCM檢測MSCs表面標志，其結(jié)果的均一性較好，其中造血干細胞的表面標志CD11b和CD45表達陰性，而CD29和CD44表達陽性（圖2）.圖1P4代的MSC呈“旋渦狀”生長

12、15;40（略）A：CD11b陰性；B：CD29陽性；C：CD44陽性；D：CD45陰性.圖2檢測MSCs表面標志的流式細胞圖（略）2.2AdGFP在293細胞中的表達及鑒定AdGFP在轉(zhuǎn)染293細胞約68 h，就可以在熒光顯微鏡下見到綠色熒光，后者隨著時間的延長而逐漸增多，24 h左右，綠色熒光最為強烈（圖3）. 約在3648 h出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為：90%100%的細胞腫脹變圓并離散，部分聚集呈葡萄狀，10%20%的細胞漂?。▓D4）. 本研究中所用重組腺病毒的E2b區(qū)為不可缺少的功能單位，將病變293細胞的裂解上清提取病毒DNA，進行E2b區(qū)的PCR鑒定，得到一條861 bp的片段（圖5），

13、提示腺病毒結(jié)構(gòu)完整.    圖3AdGFP轉(zhuǎn)染293細胞24 h所表達的綠色熒光 ×200（略）2.3AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs及其效率MSCs在感染AdGFP后，GFP的表達以24 h最為穩(wěn)定（圖6）. 當MOI值（MOI=病毒滴度/所轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)）分別為10，20，50，100，150，200，300，400和500時，F(xiàn)CM測得相應(yīng)的轉(zhuǎn)染率依次為48.7，64.8，72.1，89.1，89.9，93.1，94.4，95.8和96.8（%）（圖7），MOI從10100時候，轉(zhuǎn)染率增加最顯著，隨后盡管大幅度增加病毒的劑量，但其轉(zhuǎn)染效率不再明顯增加

14、，同時細胞病變明顯，脫落細胞增多，因此以100作為最佳的MOI來感染MSCs.圖4約3648 h出現(xiàn)病變效應(yīng)的293細胞表現(xiàn)腫脹變圓、部分已經(jīng)漂浮 ×200（略）M: 10 000 bp Marker; 1: E2B (861 bp).圖5PCR檢測AdGFP的E2b區(qū)基因表達的電泳圖（略）圖6AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs 24 h所表達的綠色熒光 ×100（略）圖7AdGFP對MSCs的轉(zhuǎn)染率（略）2.4成肌調(diào)節(jié)因子在轉(zhuǎn)染后MSCs mRNA水平上的表達AdGFP轉(zhuǎn)染后的MSCs經(jīng)RTPCR擴增，分別得到長度與目的基因MyoD（267 bp）和Myogenin（233 bp）相

15、符的片斷（圖8），其中后者的表達量較少，二者與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的MSCs的表達量相比無差別.M: 600 bp Marker; 1: actin (388 bp); 2: MyoD (267 bp); 3: Myogenin (233 bp).圖8RTPCR檢測MyoD和Myogenin基因在轉(zhuǎn)染后MSCs中表達的電泳圖（略）2.5免疫熒光檢測成肌調(diào)節(jié)因子在MSCs中的表達綠色熒光提示表達有GFP的MSCs，紅色熒光提示表達有MyoD的細胞核（MSCs或C2C12細胞），藍色熒光是對全部細胞核的復(fù)染. 只有同時出現(xiàn)三種顏色熒光的陽性細胞核，才是MyoD陽性的MSCs（圖9）. 經(jīng)檢測未見Myogeni

16、n的表達.3討論MSCs作為骨髓干細胞中的一種，含量很少（在骨髓中的全部有核細胞中僅占0.001%0.01%），但它們可以被高效地分離與擴增，并在特定的培養(yǎng)條件下，被誘導(dǎo)向多種譜系細胞（如骨骼、脂肪、軟骨和肌肉）分化，因此在再生醫(yī)學(xué)和組織工程方面倍受關(guān)注1-3. 對表面抗原的研究表明，MSC表達多種細胞黏附分子，后者在干細胞的附著與歸巢方面發(fā)揮著作用4，在本研究中，經(jīng)FCM檢測顯示大鼠MSCs主表達CD29和CD44分子.A: GFP陽性的MSCs； B: MyoD陽性的細胞； C: DAPI復(fù)染的細胞核.圖9MyoD在與C2C12成肌細胞共培養(yǎng)后的MSCs中的表達 ×200（略）G

17、FP是源于水母的一種穩(wěn)定的熒光團，具有操作簡便、可視性強并且不需外源底物等優(yōu)點而成為細胞學(xué)研究的首選工具5. 通過其在活細胞或組織中的表達，而達到觀察后者形態(tài)和功能的變化的目的5. 重組腺病毒在不依賴細胞分裂的情況下，可以將目的基因轉(zhuǎn)運至多種類型的哺乳動物細胞，并高水平表達，因此成為轉(zhuǎn)基因的一種首選載體6. AdGFP結(jié)合了GFP的示蹤特性和腺病毒轉(zhuǎn)染率高的特點，轉(zhuǎn)染MSC以后表達迅速而持久，有助于對細胞進行有效地示蹤觀察. 本研究采用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率，避免了人工計數(shù)可能帶來的誤差，敏感性和客觀性均得到提高7.成肌調(diào)節(jié)因子基因家族包括MyoD，Myf5，Myogenin和MRF4，其中M

18、yoD和Myf5在胚胎早期骨骼肌譜系的決定（determination）中起著關(guān)鍵作用，而Myogenin和MRF4則是發(fā)育中期成肌細胞向骨骼肌細胞進一步分化（differentiation）所必需的8-9. 在本研究中，轉(zhuǎn)染GFP后的MSCs在mRNA水平仍然表達MyoD和Myogenin，提示前者的成肌潛力在受到腺病毒轉(zhuǎn)染以后并未受到影響. Thayer等研究表明，通過激活內(nèi)源性的成肌調(diào)節(jié)因子，可以形成向成肌性細胞分化的正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路10. C2C12細胞是小鼠C2成肌細胞的一種亞克隆，代表著肌肉分化的早期階段，在不同的培養(yǎng)條件下，即可以作為成肌細胞不斷增殖，也可以向肌管分化11-12.

19、本研究利用該細胞的成肌特性，與MSCs共培養(yǎng)，誘導(dǎo)后者向成肌方向分化. 免疫熒光檢測結(jié)果顯示與C2C12細胞共培養(yǎng)后的部分MSCs可以表達MyoD，但未見Myogenin的表達，考慮與MSCs尚處于誘導(dǎo)分化的早期階段有關(guān). 目前認為，通過共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)分化的機制主與微環(huán)境的影響、細胞之間的融合或接觸有關(guān)12.            作者：李美山，張成，陳松林，于美娟，張雅妮，王淑輝，熊符 【關(guān)鍵詞】腺病毒Coexpression of both green fluoresc

20、e         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。本研究結(jié)果提示：構(gòu)建綠色熒光蛋白的腺病毒可以有效轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細胞并穩(wěn)定表達熒光；通過與成肌細胞共培養(yǎng)，可以激活內(nèi)源性成肌調(diào)節(jié)因子，一定程度上促使骨髓基質(zhì)干細胞向肌肉細胞定向分化.【參考文獻】1 Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: Clinical appli

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