翁長秀 山茶屬外植體區(qū)域特異性胚胎發(fā)生能力和植株再生(1)

1、In Vitro Cell. Dev. Biol. 31:8-14, January 1995 © 1995 Society for In Vitro Biology 1054-5476,/95 $02.50+0.00 山茶外植體區(qū)域特異性胚胎發(fā)生能力和植株再生 M. CRISTINA PEDROSO AND M. SALOMI PAIS Departamento de Biologia Vegetal, Faculdade de Cincias, Universidade de Lisboa, Bloco C2, Piso 1, Campo Grande, P-1700 Lisbo

2、a, Portugal （接收于1994年4月21日 ；接受于1994年8月31日;編輯：T. A. Thorpe) 摘要 建立了山茶 cv. Elegans 和 cv. Villc de Nantes直接、間接、重復胚胎發(fā)生的培養(yǎng)條件。在加了1.0mg/LN6芐基腺嘌呤和0.5mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基上，每個葉片平均直接產(chǎn)生15.3個胚胎，每個葉片產(chǎn)生(7.11.5)株植物。在加了1.0mg/LN6-芐基腺嘌呤和0.1mg/L吲哚乙酸的MS培養(yǎng)基上，從莖的直接胚胎發(fā)生，平均每個芽產(chǎn)生5.7個胚胎，每個莖產(chǎn)生2.7個。只有在重復胚胎發(fā)生以后才能獲得轉換。來源于葉的愈傷組織轉移到MS/2

3、-25培養(yǎng)基后，這些愈傷組織都能產(chǎn)生胚胎。每個愈傷組織產(chǎn)生(16.33.6)株植物。重復胚胎發(fā)生增加了胚胎的產(chǎn)量，每四個星期能達到2.3到3.6倍。 在加了2.0mg/LN6-芐基腺嘌呤，0.2mg/L吲哚乙酸和5mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基上，可以獲得次級胚胎的轉換。從葉、莖、子葉的直接胚胎發(fā)生，以及從葉得到胚性愈傷組織，這些都受限于外植體的特定區(qū)域。 關鍵詞：能力，循環(huán)胚胎發(fā)生，嵌合體胚胎發(fā)生，植物再生，山茶科，木本植物。 介紹 嵌合體胚胎發(fā)生首先在1958年有Steward et al. 和 Reinert報道。盡管過去15年進行了嵌合體胚胎發(fā)生的生理、生化、分子方面的研究，而且對于這一過

4、程的基本知識有了一定了解，但是關于影響誘導這一過程的因素以及胚胎發(fā)生的意義的知識還是比較缺乏。嵌合體胚胎發(fā)生的不同步性和少量的真正類型的胚胎發(fā)生的效率被指出是缺點。嵌合體胚胎發(fā)生為獲得大規(guī)?？寺》敝澈腿斯しN子，還有轉基因植物的克隆繁殖提供了有用的體系。山茶的嵌合體胚胎發(fā)生已經(jīng)從胚胎組織，葉，莖，根，細胞懸浮培養(yǎng)獲得。通過可以控制的和可以再生的途徑在特異的外植體區(qū)域誘導直接胚胎發(fā)生，給胚胎提供了一個結構、生理、活力和受精卵相似的環(huán)境，這會是研究植物細胞中胚胎發(fā)生能力的表達和決定的很好的體系。這些特點，在加上胚胎產(chǎn)生和植株再生的高頻率，使得這成為用于繁殖的優(yōu)良體系。 這里我們報道了從山茶屬葉、莖、

5、子葉的特定區(qū)域的直接、間接胚胎發(fā)生和植株再生。 材料和方法 植物材料 從C. japonica cv. Elegans和cv.Vifle de Nantes中得到的嫩枝在預培養(yǎng)12周之后，作為葉片和莖干的來源。嫩枝是從頂端尖端處和在體外發(fā)芽秧的節(jié)點段引發(fā)的，像先前一樣，得預培養(yǎng)四個周期后再使用。 實驗條件 除非另有說明，培養(yǎng)條件如同先前。培養(yǎng)在改良后的MS培養(yǎng)基中，pH5.5, 溫度 24+/ -1 °C,放在 16h光照下(26 #E. m -2 s-l; 寒冷的白色熒光Grolux Sylvania燈)。培養(yǎng)基中加入7g/L瓊脂作為支持劑，每兩周進行一次培養(yǎng)觀察。實驗中要求對于每

6、個培養(yǎng)基都采取同一條件下的培養(yǎng)方法。顯微鏡進行觀測應該使用立體奧林匹斯顯微鏡(S2H、日本)epifluorescence倒排光尼康相機顯微鏡(Narashige、日本)。照片拍攝換成黑白打印后，應該使用400ASA的Ektachrome柯達膠片。 直接胚狀體和分化 在完全離體培養(yǎng)了12周時間后的枝條液體改良MS培養(yǎng)基中添加25 g/L的 D-葡萄糖, 1.0 mg/L的Nt-benzyladenine (BA),和0.5mg/L的2，4-D，平均每20葉在250 ml Erlenmeyers燒瓶裝了80毫升的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待結束后,放入一個雙人鋁箔培養(yǎng)(國內(nèi)使用)。培養(yǎng)的轉數(shù)為80 rp

7、m.，每個實驗重復10次，6到10燒瓶，歷時3年。外植體的胚胎發(fā)生和胚胎的形成的數(shù)量及與外植體的比例，在培養(yǎng)開始6周后記錄。在這培養(yǎng)期間，20毫升舊的培養(yǎng)基被同等體積的MS28的培養(yǎng)液代替，MS培養(yǎng)基中以25g/L D-葡萄糖、1.0mg/LBA和0.1mg/L IBA補充。兩周后，外植體（葉嵌合體胚）被轉移到固體MS28培養(yǎng)基上培養(yǎng)以使得胚成熟。5到10組織(取決于葉子的大小)培養(yǎng)在用300cm3的玻璃器皿配制的35毫升的固體培養(yǎng)基中，并且用塑料瓶蓋封住。胚胎轉換和離體植株的再生在MS56培養(yǎng)基（MS28培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑濃度加了一倍，并加入GA35mg/L）中進行，胚胎轉換和離體植株的產(chǎn)

8、生（每片葉子正常發(fā)育成海棠離體新梢的數(shù)量）在轉移到MS56培養(yǎng)基后，每隔4和8周分別記錄數(shù)目。 直接胚的形成是從MS28培養(yǎng)基上通過保持在同一培養(yǎng)基上超過12周的亞培養(yǎng)后所獲得的嫩枝的基部發(fā)生的，重復兩次實驗，歷時3年，每次試驗用15個容器（20-30個嫩枝每容器）。莖干的一部分(5 到10 mm)培養(yǎng)在固體MS28中是用于直接胚誘導。每50個移植組織放入500 cm 3裝滿100 ml的固體培養(yǎng)基中，放在16h的光照下培養(yǎng)(26 gE. m -2 s-1)。外植體胚發(fā)生的比例和每個外植體形成胚的數(shù)目（每外植體產(chǎn)生胚的產(chǎn)量）在培養(yǎng)開始12周后開始記錄。實驗在3年內(nèi)重復8次，每次化驗5個器皿。

9、間接胚狀體和分化，將整片葉預培養(yǎng)在固體和液體MS6培養(yǎng)基中，在改良的 MS培養(yǎng)基中添加20g/L 蔗糖、1mg/L 2,4-D以及0.1mg/L的細胞分裂素。外植體的預培養(yǎng)周期是4周，根據(jù)初步結果，用25g/L的D-葡萄糖代替蔗糖的效果已經(jīng)被測試出(MS9 培養(yǎng)基)。選擇胚性愈傷組織是根據(jù)它們的起源以及培養(yǎng)的不同方式?jīng)Q定的。在培養(yǎng)開始8至12周后，胚性愈傷組織在固體和液體的基礎上形成，然后轉移到固體MS28培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以利于誘導胚(感應階段)。在培養(yǎng)8周后，愈傷組織被轉移到補充了25g/L D-葡萄糖的1/2MS培養(yǎng)基，以利于胚胎發(fā)育(生產(chǎn)期)。胚胎轉換發(fā)生在同一培養(yǎng)液中，無須轉換到新的培養(yǎng)

10、基中。當接種于MS28培養(yǎng)基6周后并接種于MS/2-25培養(yǎng)基1,4,6,8周后，記錄形成胚胎（胚胎外植體）愈傷組織的百分比和每單位愈傷組織胚胎的數(shù)量。每4周把次培養(yǎng)基放入新鮮的培養(yǎng)基中。在MS/2-25培養(yǎng)基培養(yǎng)12周后記錄每立方厘米愈傷組織幼苗的數(shù)量。 重復胚胎，由葉子和莖繁殖而來的胚胎在子葉發(fā)展階段，培養(yǎng)在MS28的培養(yǎng)基中并降低光照。每6周接種于新的培養(yǎng)基中。在接種于新的培養(yǎng)基中四周后，記錄每個嵌合體胚胎（每個外植體胚胎的數(shù)量）胚胎子葉的百分比和胚胎的數(shù)量。 微繁殖并植入土壤。由體細胞繁殖而來的幼苗在MS28的培養(yǎng)基中微繁殖，稱之為初期階段。根據(jù)vieitez 和 barciela 制

11、定裝盆和適應環(huán)境的藥物配制報告。 組織學。在形成嵌合體胚胎的外植體和所獲得的胚胎上，制作切片。切片浮在水面上，并在尼康光學顯微鏡下觀察。胚胎外植體區(qū)域的解剖圖基于手制切，在葉子切片中所示的次生維管束僅具代表性。 山茶的胚狀體 表1 C. JAPONICA植物嵌合體胚的發(fā)生和植物復蘇利用直接的、間接的和重復胚 直接胚 間接胚 重復胚 - - - - 培養(yǎng)基時間全葉 基嫩枝的基部 莖部 培養(yǎng)基 時間 Group I Group 1I Group III 培養(yǎng)基時間 體細胞胚胚胎體 MS13 3 30.9% MS28 - - - MS/2-25 1周 0% 100% 0% MS28 4周 76.4%

12、 6 60.1% 2-3% 15.1% 12 2-3% 77.6%胚產(chǎn)量 MS13 6 15.3 MS28 5.7 2.7 MS/2-25 4 0 33.5 0 MS28 4 4.3(_+9.1) (-+1.7) (-+1.2) (-+0.8) (-+2.3) 外植體的轉換MS56 4 3 7-89% 重復胚后 MS/2-25 6 0 > 95% 0 MS56 4 35-79%離體培養(yǎng)植株產(chǎn)量MS56 8 7.1 - - - - MS/2-25 12 0 16.3 0 MS56 6 4.1(4"1.5) (_+3.6l ' (_+0.9) MS13, MS 培養(yǎng)基包括

13、1.0 mg/L BA和 0.5 mg/L -2,4-D; MS28, MS 培養(yǎng)基包括 1.0 g/L BA 和 0.1 mg./L IBA, MS56, MS 培養(yǎng)基含有2.0g/L BA, 0.2 mg/L IBA 和 5 g/L GA3; MS/2-25, MS 培養(yǎng)基含有 25g/LD-葡萄糖 結果 在不同品種的之間，在胚胎發(fā)生能力以及植株復蘇方面幾乎沒有很顯著的區(qū)別,培養(yǎng)的結果都是相同的。 胚胎的直接發(fā)生和植株的再產(chǎn)生，在MS13培養(yǎng)基培養(yǎng)葉片兩至三周后，在莖葉的表面有30.9%的葉片變得膨脹和透明的白色，葉部分顯示,高皮下層細胞的數(shù)量分為形式再生胚胎.隨著再生胚的發(fā)展，葉子胚發(fā)生

14、的部位產(chǎn)生越來越飽滿的現(xiàn)象。在4和6個星期的培養(yǎng)內(nèi)，植物嵌合體胚葉表皮上快速生長.。胚胎起源于柵欄葉片中薄壁組織細胞, 遠離維管束(葉胚發(fā)生區(qū)域)。根據(jù)他們的方向樹葉中的胚胎的薄壁組織也不發(fā)達。這經(jīng)常導致那些根原基早熟的發(fā)展，或使在一個較高的細胞上部的胚胎增殖。在正常情況下,子葉也就形成了，透明的白色的胚胎與光滑的表面形成了緊湊的結構。他們總體保持在那片葉子上形成集群。剩余的集群在胚胎成熟以前發(fā)芽，胚胎形成一致的合子。經(jīng)常很少（2-3%）的球形胚與其余分化葉組織能在培養(yǎng)基上孤立發(fā)育。雖然這些胚胎是雙極結構, 他們從不同形態(tài)得出了胚胎是半透明的。轉移到固體培養(yǎng)基2周后，胚胎發(fā)生轉換。胚胎只有從集

15、群里才能發(fā)展成海棠離體新梢。它們從第一片葉子開始發(fā)育，對于胚胎發(fā)芽來說它們轉換是相似的。當轉移到固體介質, 在經(jīng)歷了重復的胚懸浮培養(yǎng)，胚胎變得發(fā)達，但絕不會發(fā)展成海棠離體新梢。直接從整個葉體細胞發(fā)育成胚途徑已經(jīng)在表1進行了總結。轉換的胚胎受到集群簇移植胚胎數(shù)目形成了更高的小集群(79%為集群小于10胚胎)。通常,胚胎轉換導致生產(chǎn)幾個腋窩型嫩枝，在某些情況下會發(fā)生異常的胚胎轉換，最高的是大胚胎星團達到37.5%。當轉移到土壤重復培養(yǎng)后，觀察到只有11%胚胎能正常發(fā)育成海棠離體新梢。 嫩枝和莖干部分 直接從胚根基部的2 - 3%部分觀察，胚胎形成于集群中相同的(形態(tài)學和組織學)合子中，胚胎形成于沒

16、有發(fā)育海棠離體新梢，但重復胚培養(yǎng)在MS28培養(yǎng)基中。胚胎轉換由次生胚獲得胚胎，相對于胚根基部的生長，末端的培養(yǎng)部分的增加使得體細胞胚胎加快生長。至于在葉片上的直接胚狀體，箴胚胎形成總是從皮下干薄壁組織開始，通過破裂了的胚胎表皮或斷端根干段產(chǎn)生。雖然胚發(fā)生的百分比為77.6%發(fā)生率很高，胚胎生產(chǎn)卻很低，并且低于標記的胚胎基部生產(chǎn)的嫩枝枝及整個葉片。莖干部分衍生的胚胎只有在MS / 2-25 培養(yǎng)基上重復培養(yǎng)后，轉移到MS56培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間才能得到。 間接胚狀體和分化 胚性愈傷組織的形成有91.6%是在在固體和液體MS6培養(yǎng)的葉片的基部出現(xiàn)的，有48.9%在葉片中產(chǎn)生，主要脈是23.7%，培

17、養(yǎng)在MS9液體生產(chǎn)中增加67.8%葉片愈傷組織。 這三組愈傷組織的獲得都是獨立培養(yǎng)的，第一組的愈傷組織是生根的，而第三組的愈傷組織是非形態(tài)因子，只有第二組愈傷組織能產(chǎn)生胚胎。這些愈傷組織起源于皮下層葉片的薄壁組織細胞，可用來觀察葉產(chǎn)生植物體細胞胚，胚胎的形成在感應階段(MS28中)是非常少見的。再6周轉接后，可觀察有4%愈傷組織的轉移，一個愈傷組織能夠產(chǎn)生4到7個胚，一周后轉接到MS/2-25中（產(chǎn)生階段)?？梢钥吹角蛐闻呤?00%的愈傷組織轉移形成的 (表1)。在MS/2-25培養(yǎng)中胚胎的形成需要經(jīng)過三個周期。第一步，轉接一周后，胚胎的產(chǎn)生是不同步的而且很低(一個愈傷組織產(chǎn)生一到四個胚)。第

18、二步，4周后轉接，胚胎產(chǎn)生是同步的而且很高(在99.8%的愈傷組織中), 每個愈傷組織能夠形成33.5(+ 0.8)胚胎 (表1)。第三個周期，在轉接至生長培養(yǎng)基中后8周形成，也是同步產(chǎn)生的。轉接期間有一個優(yōu)先發(fā)育頂芽。如果培養(yǎng)基上發(fā)生了變化，根原基可以進一步發(fā)展。海棠離體新梢數(shù)每個愈傷組織形成非常高，達到 (163 + 3.6海棠離體新梢每厘米),愈傷組織誘導不再是可見的。海棠離體新梢只能夠在震蕩的培養(yǎng)基中發(fā)育，通過觀察，海棠離體新梢沒有異常。嫩枝的培養(yǎng)是通過愈傷組織衍生產(chǎn)生海棠離體新梢的。 重疊胚 當成熟胚培養(yǎng)在MS28中減少光照后，重疊胚有76.4%產(chǎn)生于葉或根衍生的植物體細胞胚(表1)

19、。胚胎起源于三層細胞即原表皮微披角質層以下。胚胎形成于微披角質層的表面,造成了在原來基礎上的膨脹，次生胚也就產(chǎn)生了(4.3 + 2.3胚胎每個微披角質層)。每4周增加體細胞2.3 到3.6個折痕。當光照提升到一定的強度，以及材料和方法都合適時，獲得得次生胚能夠成熟。轉接到MS56中萌發(fā)后，35%到79%的胚胎能發(fā)育成為海棠離體新梢, 但離體培養(yǎng)植株的產(chǎn)量比較低為(4.1 + 0.9)(表1)。 討論 葉、莖干以及分支處的胚的獲得都是從皮下起源的。位于皮下位置的胚基因細胞被限制于隔離的葉片中，處在它們的近表面的子葉。愈傷組織的發(fā)生，只能從葉片獲得,也源于皮下組織細胞。嵌合體胚在山茶屬中總是起源于

20、同樣的外植體地區(qū), 但獨立于培養(yǎng)基，到目前為止，測試外植體的類型使用了(10、12、15)等方法。盡管皮下層細胞的形態(tài)經(jīng)常被記錄為其它物種(3,16,23-25,29,30)中,但只是為山茶的子葉和稻梗的胚軸部分進行了部分及相關反應的報告。我們更早的結果關于直接從珍稀物種上得到胚葉，顯示不同體外葉在同一個部位的反應時相關聯(lián)的。拍張x光片分析研究被控制的樹葉，在任何一種葉的部位都符合上述結論。類似的結果也能從能量分散的x射線光譜采集皮下層細胞子葉中得到。在所有情況下, 只有在預期的外植體部分進行細胞檢測才能檢測到。 擴散在不同生理梯度材料中的組織，在決定形成位置的時候起到作用，,即形態(tài)開始于外植

21、體。相反于山茶的體系, 在其他物種，胚發(fā)生反應發(fā)生在中部葉脈的附近及次要葉脈。一項關于胚葉上元素分布的研究，也類似于進行了珍稀物種山茶的研究。在這兩種情況下,梯度概念(生理或其他)似乎不足夠解釋為什么只有在特定的一些細胞組織成為主干后才能接受胚狀體。在薄層細胞區(qū)域，是視在實驗的類型表達情況而定的, 在一定的培養(yǎng)條件下,是以外植體的生理狀態(tài)為主，主要是利用切除的部分植物體進行培養(yǎng)。在楊樹進行太陽光度測定器時，葉片外植體成熟葉細胞的狀態(tài)是一個關鍵因素，以及2,4 D也能夠刺激誘導分化。我們先前的和現(xiàn)在的結果似乎表明,細胞的位置在胚發(fā)生能成為非獨立的條件，在外植體的起源(葉、莖、子葉)，或者是品種都

22、起作用。然而,早期的結果似乎表明,胚胎發(fā)生的數(shù)量受外植體起源的影響。此外,重復胚狀體的結果似乎表明, 一旦獲得能力，則是一個長期的能力。在不改變培養(yǎng)條件的情況下，所有的細胞群都能夠保留植物體細胞胚發(fā)生的能力。在從葉間接產(chǎn)生胚的培養(yǎng)體系中，得到了一個類似的結果,胚胎發(fā)生的三個周期能獲得清除生長調(diào)節(jié)劑的能力。在所有培養(yǎng)體系報道：在所有的組合的化學和物理培養(yǎng)條件中，到目前為止(未出版測試的結果)，沒有形態(tài)因子反應比體細胞胚從具體的外植體中胚發(fā)生途徑取得更好的研究進展。 目前的結果證實我們先前的研究表明是正確的，胚的完全發(fā)生可能是在山茶外植體的特定部分處。莖、葉、微披角質層的培養(yǎng)體系闡述了這個觀點，在

23、這一控制過程中，獲得特定的外植體才能夠選擇到真實的體細胞誘導類型，在研究和得到木本植物胚胎發(fā)生的能力時，可以成為非常有用的工具。比起先前的報道山茶屬(4、5、12、15,27)的結果，我們的結論認為，胚胎生產(chǎn)、胚胎轉換、植物的 恢復力，展示了山茶在體外發(fā)展培養(yǎng)體系的潛力。 感謝 我們?yōu)镋ng. Eliseu和Eng. Oliveira授權接受植物材料在Parque de Monserrate (Sintra, Portugal)上而表示感謝，這項工作是被Junta Nacional de Investigaqao Cien tifica e Tecnoltgica (Lisboa, Portu

24、gal), PhD grant BD/239/90-IF所支持的。 參考文獻 1. Ahamura, M. M.; Bassi, P.; Cavallini, A., et al. Nuclear DNA changes during plant development and the morphogenetic response in vitro of Nicotiana tabacum tissues. Plant Sci. 53:73-79; 1987. 2. Ammirato, P. V. Embryogenesis. In: Evans, D. A.; Sharp, W. R.;Am

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