IL-8單克隆抗體的研制及其生物學(xué)活性研究

1、    IL-8單克隆抗體的研制及其生物學(xué)活性研究        IL-8是機(jī)體主要的炎癥因子之一，目前已知IL-8參與了多種疾病的發(fā)展和組織損傷1，如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、缺血回灌綜合癥(包括心肌梗死和多器官衰竭)、腎小球腎炎以及其他各類感染性疾病。鑒于IL-8是炎癥性反應(yīng)的一個(gè)重要因子，建立能快速和特異檢測(cè)IL-8的方法和研制拮抗IL-8生物學(xué)活性的單抗，將為治療和明確IL-8介導(dǎo)的炎癥性病理?yè)p傷提供有效的手段。 材料與方法IL-8單抗和多抗的制備：雜交瘤的建立和兔抗

2、人IL-8多抗血清的制備按本室常規(guī)方法進(jìn)行，抗體亞類用快速鑒定試劑條（argene biosoft，F(xiàn)rance）鑒定。電泳和免疫印跡：電泳采用10%還原變性SDS-PAGE, 免疫印跡按常規(guī)方法進(jìn)行。抗體的生物學(xué)活性：IL-8在體外具有趨化中性粒細(xì)胞游走的作用2，體內(nèi)注射IL-8可有效提高外周血白細(xì)胞的數(shù)量3，在這些實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)加入適量IL-8單克隆抗體觀察抗體對(duì)IL-8生物學(xué)活性的拮抗作用。趨化試驗(yàn)2：96孔趨化板（ChemoTx, Neuro Probe），其膜厚10m，孔徑3m。新鮮分離的外周血PMN(中性粒細(xì)胞)調(diào)節(jié)其濃度至106個(gè)/ml。上層加2l的細(xì)胞懸液，下層加入29l不同濃度

3、(0、0.01、0.1、1、10、100g/ml)的抗體和10ng/ml IL-8，樣品用0.5% BSA-RPMI 1640稀釋, 對(duì)照樣品為0.5% BSA-RPMI 1640。37 CO2培養(yǎng)箱放置40?min后，70%甲醇固定后吉姆薩液染色觀察下層膜面上的細(xì)胞，用400×光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)算下層細(xì)胞數(shù)。趨化指數(shù)=(樣品遷移細(xì)胞數(shù))/(對(duì)照樣品遷移細(xì)胞數(shù))白細(xì)胞動(dòng)員試驗(yàn)3：體重20g雄性BALB/c小鼠，每只注射1mg的不同抗體(SI96、SI97、SI98)和20g IL-8，對(duì)照組僅注射生理鹽水。45?min后用氯仿麻醉，心臟穿刺取血，EDTA抗凝。立即進(jìn)行外周血白細(xì)胞常規(guī)計(jì)

4、數(shù)。動(dòng)員指數(shù)=(實(shí)驗(yàn)組外周血白細(xì)胞數(shù))/(對(duì)照組外周血白細(xì)胞數(shù))酶聯(lián)檢測(cè)法(ELISA)的建立：采用夾心放大法，其步驟：以100l/孔2g/ml的IL-8單抗包板，包板液為0.05mol/L pH9.6碳酸氫鈉緩沖液，4過(guò)夜；用0.1% Tween20-PBS, pH7.4，洗2次后，用300l 3 BSA-PBS 37封閉2?h。之后分三步加入標(biāo)準(zhǔn)IL-8、兔抗IL-8多抗、ALP-羊抗兔球蛋白多抗(Imuno Tech Inc, France)，每一步都37反應(yīng)2?h，洗4遍，最后加入底物（4-nitrophenyl phosphate disodium salt, Merck）顯色。1?

5、h后用1mol/L NaOH終止反應(yīng)，405nm測(cè)吸光度（A）值。結(jié)果和討論1.雜交瘤細(xì)胞株的建立：經(jīng)篩選獲得3株穩(wěn)定分泌IL-8單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為SI96、SI97和SI98。SI96、SI97為IgM亞類，SI98為IgG1亞類?？贵w純化后經(jīng)還原性SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)，具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)特征重鏈和輕鏈區(qū)。免疫印跡檢測(cè)顯示，3株抗體可特異性識(shí)別位于相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為9×103 處的標(biāo)準(zhǔn)IL-8抗原。在體內(nèi)、體外均能明顯抑制IL-8的生物學(xué)活性，在體外趨化實(shí)驗(yàn)中，隨著加入抗體濃度的增加，3株抗體均能完全抑制IL-8對(duì)PMN的趨化活性。除此之外，我們還觀察到一個(gè)有趣

6、的現(xiàn)象，24孔板內(nèi)新鮮分離的PMN中加入IL-8后，能使PMN迅速聚集成團(tuán)，預(yù)先加入適當(dāng)濃度的這3株抗體均能明顯抑制這種聚集成團(tuán)現(xiàn)象，聯(lián)合應(yīng)用效果更顯著。上述實(shí)驗(yàn)表明，3株抗體均可作為拮抗IL-8生物學(xué)活性的拮抗劑。鑒于3株抗體均能拮抗IL-8生物學(xué)活性，將來(lái)在體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用，可能對(duì)預(yù)防缺血回灌綜合癥會(huì)產(chǎn)生更好的效果。國(guó)外業(yè)已有人做IL-8的鼠源性單克隆抗體人源化工作，以便用于臨床試驗(yàn)性治療各種缺血回灌綜合癥，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到用IL-8中和性抗體治療缺血回灌綜合癥的相關(guān)性報(bào)道。因此我們建立的3株拮抗人IL-8生物學(xué)活性的鼠源性單抗，為將來(lái)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性治療各種缺血回灌綜合癥提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.

7、抗體生物學(xué)活性：以PMN為靶細(xì)胞，SI96、SI97和SI98在體外能明顯抑制IL-8對(duì)PMN的趨化作用（1），隨著抗體濃度的增加，3株單抗均能完全抑制IL-8對(duì)PMN的趨化活性。在體內(nèi)，3株抗體均可不同程度抑制IL-8對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞的動(dòng)員作用（2）?？贵w在體內(nèi)、外具有拮抗IL-8生物學(xué)活性的作用。1不同單抗對(duì)IL-8趨化活性的抑制作用Fig 1. Inhibition of chemotactic activity of IL-8 by three McAbsControl: anti B7-1 McAbs; IL-8 contentration: 10ng/ml3.酶聯(lián)檢測(cè)結(jié)果ELIS

8、A標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度：將測(cè)定的A值與IL-8濃度作半對(duì)數(shù)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)IL-8濃度為14pg/ml，SI98包板的酶聯(lián)檢測(cè)A值為0.178±0.028，明顯高于空白對(duì)照的A值(0.139±0.024)，所以其最高檢測(cè)靈敏度可達(dá)14pg/ml。SI96和SI97因非特異性顯色偏高，其檢測(cè)靈敏度僅分別為123pg/ml和370pg/ml。以SI98建立的IL-8酶聯(lián)檢測(cè)吸附法，在14pg/ml至10ng/ml時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為r=0.9793，呈高度相關(guān)性。用酶聯(lián)法測(cè)定SI98與GM-CSF、rIL-1、IL-6、TNF-和IL-8家族中的MIP-1無(wú)明顯交叉反應(yīng)。許多炎癥疾病包括

9、各種白血病均有IL-8水平升高的現(xiàn)象4，及時(shí)檢測(cè)和跟蹤血清或組織液中的IL-8水平，將有助于進(jìn)一步闡明IL-8生理、病理作用，明確其臨床意義。為此我們利用SI98的高特異性，建立了一套檢測(cè)IL-8的ELISA方法，其靈敏度明顯高于普通的雙抗夾心法和放免法，可用于特異性檢測(cè)各種病理性升高的IL-8。2抗體抑制IL-8升高外周血白細(xì)胞的作用Fig 2. Inhibition of leukocytosis of IL-8 by McAbs*Comparison with IL-8 group (t test, P<0.05); IL-8 concentration (10g/ml); Mon

10、oclonal antibody concentration (1mg/ml)基金項(xiàng)目：江蘇省科委優(yōu)秀青年教師基金資助項(xiàng)目（BQ96016）；國(guó)防科工委基金資助項(xiàng)目(Y5573162-02）劉繼明(碩士研究生)，張學(xué)光(導(dǎo)師)作者單位：劉繼明(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室)張毅(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室)朱華亭(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室)邱玉華(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室)王江方(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室)張學(xué)光(蘇州醫(yī)學(xué)院免疫室)馮麗瑾(蘇州第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)參考文獻(xiàn)1，Harada A, Sekido N, Akahoshi T, et al. Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. J Leukoc Biol, 1994, 56:559-564.2，F(xiàn)uruta R, Yamagishi J, Kotani H, et al. Production and characterization of recombinant human neutrophil chemotactic factor. J Biochem, 1989, 106:436-441.3，Jagels MA, Hugli TE. Neutrophil chemotactic factors promote leuk