趨淋巴抗癌藥絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物的合成及生物學性質的研究

1、    趨淋巴抗癌藥絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物的 合成及生物學性質的研究        摘要利用右旋糖酐(T10500)局部注射后可選擇性被網(wǎng)狀上皮細胞或巨噬細胞通過胞飲作用攝取，而不會透過毛細血管壁進入血液，在體內(nèi)很快被代謝，無毒無滯留的特性，將一定分子量的右旋糖酐(T77)與抗腫瘤小分子藥物絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)通過一個間隔基偶聯(lián)成高分子靶向抗腫瘤藥物：絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物(MMC-D)，對偶聯(lián)物的生物學性質進行研究，并將該偶聯(lián)物用于口腔

2、癌淋巴轉移的實驗性研究中，實驗結果說明MMC-D具有強的抗腫瘤活性，并具有明顯的趨淋巴靶向性.關鍵詞高分子靶向抗腫瘤藥物；絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物；趨淋巴靶向性Synthesis of the Anticancer Drug with Affinity to LymphMMC-Dextran Conjugate and Studies on Its Biological PropertiesYan Zhongqin,Zhong Yuguo(School of Pharmacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)We

3、n Yuming,Qiu Chengping(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)AbstractSince DextranT10500 can be uptaken by megalophage and reticulum epithelial cells,and it can not penetrate the walls of the blood capillaries into the blood,the authors designed a kind of ma

4、cromolecular anticancer drug with affinity to lymph,Drug-Dextran conjugate.This kind of conjugate is conjuation of Dextran and micromolecular anticancer agent mitomycin C(MMC)by a space.We used this conjugate in the experimental therapy of lymphatic transfer of animal oral cavity cancer.All the resu

5、lts of the tests indicated that MMC-D had strong affinity to lymph,all the same MMC-D and MMC had almost the same sensitivity to the test cells.Key wordsmacromolecular anticancer drug;MMC-Dextran conjugate;affinity to lymph轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特性之一，淋巴轉移在腫瘤的轉移中很常見，而且嚴重影響治療效果1.近年來對淋巴轉移的化療藥物研究最多的是高分子靶向抗腫瘤藥物.其

6、重點在于尋找選擇性更強，治療效果更好的載藥體系.在該類藥物的研究中，以多糖如葡聚糖，甲殼胺作載體的很多2.這類偶聯(lián)物是通過淋巴細胞特異性攝取具有一定分子大小的偶聯(lián)物的特性，將偶聯(lián)物濃集于靶組織區(qū)域3.由于該種偶聯(lián)物具有較大的分子體積，不能透過毛細血管壁進入血液，只能被網(wǎng)狀上皮細胞或巨噬細胞通過胞飲作用，將偶聯(lián)物整體攝入細胞內(nèi)，然后在酶的作用下，水解出活性物質，起到殺死腫瘤細胞的作用.因而這類高分子載體靶向藥物最適于淋巴結處腫瘤或淋巴轉移腫瘤的治療，且載體本身無抗原性.絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)是一種抗腫瘤抗生素，對各種革蘭氏陽性菌有強的抗菌作用.臨床常用的抗腫瘤藥物，其分子量

7、小，毒副作用大，不能選擇性地對淋巴轉移癌起作用.而右旋糖酐(T10500)能選擇性地被淋巴系統(tǒng)攝取3，作者將小分子抗腫瘤藥物MMC與右旋糖酐偶聯(lián)成高分子靶向抗腫瘤藥物，用于口腔癌淋巴轉移的導向治療.1合成路線設計右旋糖酐的活化、間隔基的偶聯(lián)及MMC-D的合成，如1所示.Fig.1The route of synthesis2實驗方法及結果儀器：島津UV-2201紫外檢測儀，LKB-2023型、85-2型磁力恒溫攪拌器(上海司樂儀器廠)，LG-3型多用冰凍干燥機，PHB-4型酸度計(上海雷磁儀器廠)，2F-型三用紫外分析儀(上海碩村電光儀器廠)，P-E 983G紅外測定儀，Carlo Erba

8、1106型元素分析儀，MR700型酶標儀，Coulter Epics ELite ESP流式細胞儀.藥品：右旋糖酐(Dextran,T77,Sigma Chemical Co.)，溴化氰(Merck公司產(chǎn)品)，6-氨基己酸(上海試劑三廠)，EDC1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(上海麗珠東風生物技術有限公司)，絲裂霉素(MMC，浙江海門制藥廠)，四氮唑(MTT，分析純)，DMSO(分析純)，PI染液.細胞：0-1V(宮頸癌細胞)，Tca8113(人舌癌細胞)，人白血癌細胞K562，高淋巴轉移細胞株小鼠宮頸癌U14(中國醫(yī)學科學院實驗醫(yī)學研究所建株，購于四川抗生素研究所藥理室).R

9、PMI 1640，10%小牛血清和抗生素為培養(yǎng)基.成年金黃地鼠(NIH)雌雄各半(購于四川抗生素研究所).2.1絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物(MMC-D)T77的合成及鑒定將0.50 g右旋糖酐溶于50 mL注射用水中，在16條件下攪拌溶解成無色澄清的溶液，分次加入0.28 g溴化氰無色粉末，用1 mol/L氫氧化鈉調pH 11.0，反應16 min后，加入0.50 g 6-氨基己酸，攪拌溶解，用1 mol/L鹽酸調pH 9.0，于16條件下反應24 h，然后在4 條件下用pH 9.0的碳酸鈉溶液透析3 d，至透析外液用硝酸酸化后與硝酸銀反應無沉淀生成，取少許透析內(nèi)液減壓室溫干燥.IR(KBr)c

10、m-1：3415，2932，1637，1560，1407，1014.取出透析內(nèi)液，加入50 mg絲裂霉素，攪拌溶解成藍色溶液，再加入1.00 g EDC，攪拌溶解后，用1 mol/L鹽酸調pH 55.5，于16 條件下反應24 h，反應完成之后，在4 條件下用水透析3 d，至透析外液無小分子藥物MMC透出，取出內(nèi)液，呈紫藍色溶液，紫外分光光法分析溶質含量=22 000(98.9%).冰凍干燥后，用Sephadex G-50柱進行色譜分析，微孔濾膜(0.65m)過濾，分裝于10 mL安瓿中，相當于1.0 mg/瓶，冰凍干燥，熔封，得MMC-D凍干制劑，4 避光保存.元素分析實測值(%)：C 40

11、.97，N 6.21，H 5.78.2.2偶聯(lián)物中小分子藥物的含量測定取冷凍干燥后的偶聯(lián)物MMC-D 11.7 mg(真空干燥24 h)，定容到50.0 mL水溶液，紫外364 nm處測定其含量為6.67%(w/w,相當于MMC的含量).2.3體外藥敏實驗2.3.1MTT法測定MMC-D對癌細胞的敏感性4將培養(yǎng)48 h的細胞分別接種至96孔板內(nèi)，每孔接種10 000個細胞(100 L接種后擴增，待孔板內(nèi)長滿細胞為止)，共六板.于每板上的每種細胞中加入不同濃度的二種藥物各100 L/孔，藥物濃度為：0.025，0.125，0.25，1.25，2.5，25，50 g/mL.然后于37 ，5%二氧化

12、碳的孵箱中培養(yǎng)，加入藥物后第1，2，3，4，5，6 d終止藥物反應，加入MTT(20 L/孔)，2 h后去掉反應混合液，再加入DMSO，振搖10 min，顯紫色，于酶標儀上測定光密度(OD).即可測出相當于活細胞的數(shù)目值.經(jīng)計算機EXCEL程序數(shù)據(jù)處理，比較50 g/mL的MMC，MMC-D二種藥物分別對0-1 V，Tca8113兩種細胞的作用強弱，結果見表1.Tab.1OD values tested by MTT assaySampleO-1VTca8113Time/dTime/d123456123456MMC(50 g/mL)0.45100.61400.40750.37700.30300

13、.17200.63900.81400.53200.46000.45800.2235MMC-D(50 g/mL)0.51400.62600.47200.59950.47850.26750.67800.82500.81900.88800.52600.4260MTT法藥敏實驗結果表明：MMC，MMC-D二種藥物對鱗癌細胞均有一定的殺傷作用，其中MMC-D的藥效稍低于MMC，且起效較MMC慢，可能是由于MMC-D在體內(nèi)有一水解過程，但持效長.2.3.2應用流式細胞儀測定法測定MMC，MMC-D對白血癌細胞K562的敏感性5取對數(shù)生長的白血癌細胞K562置于24孔板(200 000個/孔)，每孔體積1.

14、0 mL，共8孔.每孔分別編號，并于每孔分別加入濃度為0.5 mg/mL的藥液10，30，50 L，共2種藥物(MMC-D，MMC)于37，5%二氧化碳的孵箱中孵育48 h.在顯微鏡下觀察細胞生長情況，有成團或浮起的細胞，有的細胞核固縮，碎裂.將細胞培養(yǎng)板取出，用滴管吹打數(shù)次，使細胞最大程度游離，將每孔的細胞懸液盡可能全部地轉移到流式細胞儀專用試管中，一一對應并編號，以1 800 r/min離心5 min，傾去上清液，試管底部留下細胞，于每管中加入0.8 mL的PI染液，染色30 min，待測定.用流式細胞儀進行細胞凋亡和生長周期變化分析，結果見表2和表3. Tab.2The percenta

15、ge(%) of apoptosis cells in total K562 cellstreated by different concentrations of MMC and MMC-D at different timeControlMMCMMC-DConcentration/g.mL-1Concentration/g.mL-151525515254.430.639.445.527.235.744.0Tab.3The effects of different concentrations ofMMC and MMC-D on the growth period of K562 at d

16、ifferent timeSampleConc./g.mL-1The percentage of every growth period/%G1G2Scontrol50.914.634.4550.04.445.6MMC1561.33.235.42569.91.029.1538.33.558.3MMC-D1552.15.941.92559.32.238.5表2和表3顯示MMC和MMC-D均對癌細胞K562有較強的凋亡誘導作用，對癌細胞的生長周期影響也相當大，且都有濃度依賴性.MMC-D的生物活性比MMC略低，但仍保持強的活性.這一結果與MTT法對MMC-D的藥敏性實驗結果一致.2.4趨淋巴性研究

17、2.4.1微生物測定法確定MMC-D的效價6用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis 63501)作試驗菌，制備合格的枯草芽孢桿菌懸液，取0.3%懸液5 mL加入含有培養(yǎng)基20 mL的雙碟中，以等距離安置不銹鋼管4枚，分別滴加不同濃度的MMC和MMC-D，加入藥物后于37培養(yǎng)1618 h，量取抑菌圈直徑大小，效價按抗生素檢測法二劑量公式計算，得出1 g MMC-D相當于0.115 g的MMC.2.4.2小鼠體內(nèi)藥物分布試驗在已建立的成年金黃地鼠(NIH)頸淋巴轉移小鼠宮頸癌U14細胞的模型中，選擇30例，分3個時間段即分成三組，每組10只，每兩只小鼠的血和淋巴分別結合成一個樣本，在

18、雙頰部腫瘤瘤周給藥MMC-D 0.2 mg(相當于MMC的含量)，注射后12，24，48 h斷頸處死，摘眼球取血，留取淋巴結，稱重.另取淋巴結送光鏡檢測.對照組12只NIH小鼠尾靜脈注射0.1 mg MMC，注藥后12，24，48 h斷頸處死，同法留取樣本.取6只NIH正常小鼠，不給藥，作陰性對照.在裝有培養(yǎng)基的平皿內(nèi)接種枯草桿菌63501，待菌體鋪滿培養(yǎng)基表面后放入鋼杯，在杯內(nèi)分別加入淋巴結組織生理鹽水勻漿(1 mL/g)上清液和小鼠血漿離心上清液，37 孵育1618 h后，測定培養(yǎng)基表面枯草桿菌抑菌環(huán)直徑大小，根據(jù)其生物活性效價換算成淋巴結和血漿中藥物濃度，進行統(tǒng)計分析處理.淋巴結中藥物濃

19、度見表4，在血漿中各時間段的樣本以及對照組淋巴結樣本中均未檢測出藥物. Tab.4The concentrations of MMC-D in the lymph node of mice with U14g/gGroupTime/hGroupTime/h122448122448137.5228.7321.32435.3527.3222.47233.4329.5220.54530.4728.4519.39330.2929.2119.05P0.01 該生物檢測方法的最低檢測限度為3.8 g/g組織，因此可以得出淋巴結內(nèi)藥物濃度比血液中的藥物濃度至少高6倍以上.即MMC-D較MMC具有高的親淋巴性

20、.3討論3.1MMC-D的合成，是采用溴化氰活化法7，8.溴化氰是一種強的氰化劑，活性很高，因此活化溫度不宜過高，試驗發(fā)現(xiàn)溫度偏高(高于23)，活化過快，活性物質極易失活，溫度偏低(低于4)，生成的活性物質在水中的溶解性降低.經(jīng)過多次試驗發(fā)現(xiàn)反應溫度為16最好.活化時間也不易過長，活化時間過長(超過30 min)，活性物質失活，偶聯(lián)率降低，試驗發(fā)現(xiàn)反應在816 min較好.3.2測定腫瘤化療藥物敏感性的方法有多種.最近發(fā)現(xiàn)許多化療藥物均能誘導敏感細胞發(fā)生凋亡10.目前國內(nèi)外檢測凋亡最準確的方法是流式細胞儀和DNA瓊脂糖電泳.作者運用流式細胞儀測定法對偶聯(lián)物MMC-D的凍干制劑對細胞K562的敏

21、感性進行測定.流式細胞儀測定法能更客觀地反映腫瘤細胞藥物作用后的功能和形態(tài)學變化特征，同時還能觀察藥物不同濃度在不同時間引起腫瘤細胞動態(tài)變化特征以及分析藥物對細胞的生長周期的影響，較MTT法能更客觀、更準確地反映藥物對細胞的敏感性.3.3MMC為抗菌素類非特異性抗腫瘤藥物，既具有抗癌作用，還具有抗菌作用.因此可以通過藥物對細菌抑菌環(huán)的大小來間接測定血漿和淋巴組織中的藥物濃度.試驗結果顯示，局部給MMC-D后，小鼠頸淋巴結內(nèi)藥物濃度較血漿中至少高6倍以上，該結果支持了作者對趨頭頸部淋巴抗腫瘤藥物的設計思想.同時由于MMC-D的體內(nèi)半衰期大于24 h，因此設計的取標本的時間段較長.而MMC的半衰期為8 min，在預試中發(fā)現(xiàn)MMC靜注動物體內(nèi)后30 min以內(nèi)，頸淋巴結中仍然沒有檢測出藥物.因此所選時間段對MMC基本不受其半衰期的影響.作者簡介：嚴忠勤通訊聯(lián)系人作者單位：嚴忠勤鐘裕國華西醫(yī)科大學藥學院，成都 610041溫玉明邱成平華西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院頜面外科，成都 610041參考文獻1鄭家偉，陳寶勇.國外醫(yī)學腫瘤分冊.1995，22(6)：3433452Hasnida M,Takakura Y,Matsumo S,et al.Regeneration characteristics in relation to its activit