bcl2反義寡核苷酸對小細胞肺癌細胞NCIH69放射敏感性的影響

1、bcl2反義寡核苷酸對小細胞肺癌細胞NCIH69放射敏感性的影響        【摘要】 目的 研究bcl2反義寡核苷酸對人小細胞肺癌細胞NCIH69放射敏感性的影響。方法 將NCIH69細胞培養(yǎng)傳代,然后將細胞分為反義寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、無義寡核苷酸組和空白對照組,通過脂質(zhì)體將不同寡核苷酸導(dǎo)入細胞中,用WesternBlot法檢測Bc            【摘要】  目的 研

2、究bcl2反義寡核苷酸對人小細胞肺癌細胞NCIH69放射敏感性的影響。方法 將NCIH69細胞培養(yǎng)傳代,然后將細胞分為反義寡核苷酸組、正義寡核苷酸組、無義寡核苷酸組和空白對照組,通過脂質(zhì)體將不同寡核苷酸導(dǎo)入細胞中,用WesternBlot法檢測Bcl2蛋白的表達。 采用直線加速器分別以不同劑量(0、2、4、6、8、10 Gy)X線照射4組細胞。收集照射后的細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,MTT法測定細胞存活分數(shù)。結(jié)果 WesternBlot雜交顯示反義寡核苷酸組無Bcl2蛋白表達,相對正義寡核苷酸組、無義寡核苷酸組及空白對照組Bcl2蛋白表達明顯受到抑制(F=7.2415.31,q=5.037

3、.80,P<0.01)。細胞經(jīng)X線照射后,反義寡核苷酸組細胞凋亡率明顯高于空白對照組,差異具有顯著性(F=7.2415.31,q=5.037.80,P<0.01);正義寡核苷酸組和無義寡核苷酸組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。4組細胞接受輻射后,反義寡核苷酸組在未照射和照射不同劑量后的存活分數(shù)均低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.0445.56,q=5.1014.75,P<0.01),而正義寡核苷酸和無義寡核苷酸組與空白對照組比較則無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論 bcl2反義寡核苷酸能有效封閉bcl2基因的表達,增強小細胞肺癌細胞NCIH69對X線的敏感性。  【關(guān)鍵詞】

4、  基因,bcl2;癌,小細胞；放射療法,適形;寡核苷酸類,反義 ABSTRACTObjectiveTo study the effect of bcl2 antisense oligodexynucleotides on radiosensitivity of the cell line NCIH69 of human smallcell lung cancer.MethodsCultured NCIH69 cells were divided into antisense oligodexynucleotides (ASODN), sense oligodexynucleotid

5、es (SODN), nonsense oligodexynucleotides (NSODN) and blank groups. The different Bcl2 oligodexynucleotides were transfected into corresponding cells using Oligofectamine. Expression of Bcl2 was examined by WesternBlot. The different group cells were irradiated by different dose of Xray (0,2,4,6,8, a

6、nd 10 Gy) via 6MV linearity accelerator, the apoptotic cells were then detected by flow cytometry and cell growth assessed by MTT test.ResultsThe Bcl2 expression in ASODN group was significantly inhibited compared with other groups (F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P<0.01). The apoptotic rate of ASODN gr

7、oup was significantly higher than that of other groups (F=11.04-45.56,q=5.10-14.75,P<0.01), and the survival fraction of ASODN group was significantly lower than that of the others.ConclusionThe bcl2 ASODN enhances the radiosensitivity of the cell line NCIH69 of smallcell lung cancer via blocking

8、 bcl2 gene expression.       KEY WORDSGenes, bcl2; Carcinoma, small cell; Radiotherapy, computerassisted; Oligonucleotides, antisense        小細胞肺癌被認為是放、化療敏感腫瘤，但治療效果不佳，多數(shù)小細胞肺癌最終表現(xiàn)為化療耐藥、放療抗拒。如何提高對放療抗拒的小細胞肺癌的放射敏感性是肺癌研究的一個重要課題。bcl2基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細胞凋亡調(diào)控基

9、因，它在小細胞肺癌中有較高的表達13。已有研究表明，凋亡控制基因與放療敏感性有關(guān)4。本研究將bcl2反義寡核苷酸作用于小細胞肺癌細胞NCIH69，探討其對小細胞肺癌放療敏感性的影響及其機制。 1  材料和方法 1.1  細胞系     小細胞肺癌細胞株NCIH69，購于上海午立生物技術(shù)有限公司，在含體積分數(shù)0.10的胎牛血清的RPMI 1640中培養(yǎng)，于37 體積分數(shù)0.05的CO2溫箱中孵育。 1.2  bcl2寡核苷酸序列     參考文獻4合成反義寡核苷酸序列為：5AATCCTCCCCCAGTTCA

10、CCC3,針對bcl2基因第141147個密碼子合成正義寡核苷酸序列為：5GGGTGAACTGGGGGAGGATT3,無義寡核苷酸序列為：5TCCCACCTCACCTACATCCG3，以上皆經(jīng)全鏈硫代修飾，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。 1.3  脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染寡核苷酸     脂質(zhì)體Oligofectamine Reagent購于Invitrogen Life Technologies公司。細胞分4組：空白對照組，僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體；正義寡核苷酸組，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸；無義寡核苷酸組，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染無義寡核苷酸；反義寡核苷酸組，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)

11、染反義寡核苷酸。置于6孔板上培養(yǎng)，每孔細胞濃度2×108/L，24 h后清除細胞培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基OptiMEM清洗2次，每孔重新加入OptiMEM 800 L，輕輕混勻。取出20 mol/L的寡核苷酸10 L、脂質(zhì)體5 L分別稀釋于175、10 L的OptiMEM無血清培養(yǎng)基中，將稀釋后的寡核苷酸和脂質(zhì)體混勻，室溫下孵育20 min。 每孔加入200 L寡核苷酸脂質(zhì)體混合物，置于孵箱內(nèi)孵育4 h。最后，換用體積分數(shù)0.20胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h。 1.4  Western Blot免疫印跡法檢測Bcl2蛋白    

12、; 將轉(zhuǎn)染后的細胞于RIPA裂解液中裂解，12 g/L SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)至NC膜上，bcl2鼠抗人單抗為一抗（工作液110稀釋），HRP羊抗鼠IgG（工作液110稀釋）作為二抗，DAB顯色。 1.5  X線照射     收集轉(zhuǎn)染72 h后的4組細胞，即正義、反義、無義寡核苷酸組和空白組，分別轉(zhuǎn)移至6孔板中，調(diào)整細胞數(shù)為2×109/L，板上加1 cm厚組織補償,室溫下X線照射（6MV加速器X線，源皮距90 cm）0、2、4、6、8、10 Gy,照射后置于孵箱中，48 h后測定細胞凋亡率。 1.6  細胞凋亡率的檢測  

13、   收集照射后48 h的4組細胞，調(diào)整細胞數(shù)為5×108/mL，以1 000 r/min離心5 min， 棄上清， 冷PBS洗2次，加入50 mg/L PI低滲液（含NP40、RNA酶）200 L，混勻,4 避光染色30 min，400目篩網(wǎng)過濾。FACS管上樣檢測DNA含量，激發(fā)波長488 nm，CV值<2，F(xiàn)SC/SSC設(shè)門。收集門內(nèi)10 000個細胞，用CELL Quest軟件分析細胞凋亡率。 1.7  MTT測定存活分數(shù)     收集照射后的4組細胞，調(diào)整細胞數(shù)為5×107/L。取96孔板，每孔加入

14、200 L稀釋好的細胞，每組設(shè)4個復(fù)孔，孵箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入5 mg/L的MTT各10 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心去上清，每孔加入200 L二甲基亞砜，混勻，用酶標儀檢測492 nm波長處的吸光度值，計算存活分數(shù)（SF）。SF=實驗組的平均吸光值/空白對照組的平均吸光值×100%。每組重復(fù)試驗3次，取平均值。     1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS 11.5軟件對結(jié)果進行單因素方差分析。 2 結(jié)果 2.1 Bcl2蛋白表達結(jié)果 WesternBlot雜交結(jié)果表明，Bcl2蛋白在空白對照組、正義寡核苷酸組、無義

15、寡核苷酸組細胞中高表達            1.8  統(tǒng)計學(xué)處理     實驗數(shù)據(jù)以±s表示，用SPSS 11.5軟件對結(jié)果進行單因素方差分析。 2  結(jié)果 2.1  Bcl2蛋白表達結(jié)果     WesternBlot雜交結(jié)果表明，Bcl2蛋白在空白對照組、正義寡核苷酸組、無義寡核苷酸組細胞中高表達，在相對分子質(zhì)量26萬處顯示清晰的蛋白條帶，在反義寡核苷酸組細胞中不表達，在

16、相應(yīng)位置則未見蛋白條帶（圖1）。 2.2  各組細胞凋亡率比較     反義寡核苷酸組在受到不同劑量X線照射后的凋亡率均高于空白組，差異有顯著性（F=7.2415.31,q=5.037.80,P<0.01），而正義寡核苷酸組和無義寡核苷酸組與空白對照組比較則無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。表1  不同劑量X線照射細胞48 h后各組細胞凋亡率比較(略) 2.3  各組細胞存活分數(shù)比較     反義寡核苷酸組在未照射和照射不同劑量后的存活分數(shù)均低于空白對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.0445.56,q=5

17、.1014.75,P<0.01)，而正義寡核苷酸組和無義寡核苷酸組與空白對照組比較，差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。表2  不同劑量X線照射各組細胞后的存活分數(shù)（略） 3  討 論     在肺癌中，小細胞肺癌約占20%左右。小細胞肺癌具有特異的生物學(xué)行為，如惡性度高、生長快、倍增時間短、分裂指數(shù)高、早期出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移、自然生存期短等，臨床治療效果差。放射療法是治療惡性腫瘤的主要手段之一。小細胞肺癌對放射治療較敏感，但很多病人在治療中出現(xiàn)放射抗拒性。如何進一步提高小細胞肺癌的放射敏感性，從而提高局部控制率和病人生存率，是目前肺癌研究一個重要課題

18、。bcl2是近年發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡調(diào)控基因, 其異常表達與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān),與小細胞肺癌的關(guān)系尤為密切。有研究顯示，60%80%的小細胞肺癌存在Bcl2蛋白過度表達13。bcl2作為細胞凋亡的重要調(diào)控基因，其過量表達可能是導(dǎo)致腫瘤形成和放化療耐受的主要原因之一?；赽cl2基因的反義治療可以抑制Bcl2蛋白的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡，恢復(fù)耐藥細胞對化療藥物的敏感性6,通過反義技術(shù)來封閉bcl2凋亡抑制基因的表達是腫瘤治療的新思路。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將bcl2 反義寡核苷酸導(dǎo)入小細胞肺癌細胞NCIH69中，WesternBlot免疫印跡顯示,轉(zhuǎn)染后bcl2 反義寡核苷酸成功封閉了bcl2基因的

19、表達。     bcl2基因可導(dǎo)致腫瘤細胞放射抗拒。PILLAI等7對宮頸癌研究后發(fā)現(xiàn)，bcl2是通過抗氧化途徑防止細胞凋亡,認為放療是通過產(chǎn)生氧自由基造成DNA損害后引起細胞凋亡的, bcl2表達增加可引起腫瘤對放療的敏感性降低。SIRZEN 等8選用U1285、 U1906和U1810等3種放射敏感性不同的肺癌細胞株，檢測3種細胞輻射后產(chǎn)生凋亡的不同。結(jié)果表明，放射抗拒的U1810細胞株較放射敏感的U1285和U1906細胞株 bcl2/Bax明顯增高，提示高表達Bcl2蛋白易產(chǎn)生輻射耐受。本研究采用bcl2 反義寡核苷酸封閉小細胞肺癌細胞Bcl2蛋白表達，經(jīng)

20、不同劑量X線照射后，細胞存活率明顯下降，提高了小細胞肺癌細胞的放療敏感性。     研究表明，腫瘤受單一劑量照射后凋亡指數(shù)與放射敏感性呈正相關(guān)4。日本學(xué)者報道，在其實驗的5種腫瘤細胞中，放射最敏感的室管膜母細胞瘤細胞輻射誘導(dǎo)的凋亡率最高，最不敏感的惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡率最低9,10。上述資料提示凋亡與放射敏感性密切相關(guān)。本研究采用流式細胞儀測定細胞凋亡率，結(jié)果接受不同劑量X線照射后，經(jīng)bcl2 反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染的小細胞肺癌細胞凋亡率明顯高于其他細胞組。提示促進細胞凋亡是bcl2 反義寡核苷酸產(chǎn)生放療增敏效應(yīng)的機制之一。     總之，本

21、研究顯示bcl2 反義寡核苷酸應(yīng)用與放療結(jié)合，提高了小細胞肺癌的放療敏感性，為小細胞肺癌的反義基因治療與放療提供了實驗基礎(chǔ)。 【參考文獻】   1姚和瑞,歐陽能太,李錦梅. 癌基因Bcl2蛋白在肺癌組織中的表達J. 癌癥, 1997,16(5):348349. 2劉慧,孔慶兗,吳永平,等. SCLC與NSCLC基因調(diào)控的差異凋亡調(diào)控基因p53、Bcl2表達的差異及意義J. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2003,23(2):115118.  3STEFANAKI K, RONTOGIANNIS D, VAMVOUKA C, et al. Immunohistochemical dete

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