人血白蛋白—藥典注釋

1、1人血白蛋白人血白蛋白是最早從人血漿提取并獲得大規(guī)模生產和應用的血液制品。 白蛋 白的研發(fā)始于二次世界大戰(zhàn)，為搶救傷員美國哈佛大學醫(yī)學院Cohn教授等人于1942年1月成功從人血漿提純了白蛋白用于戰(zhàn)時傷員搶救。 發(fā)展至今已有60年 的歷史。我國人血白蛋白的生產始于上世紀70年代初期， 中國生物制品規(guī)程1979年版開始收載，歷經中國生物制品規(guī)程1990年版、2000年版、中國 藥典2005年版、2010年版收載。人血白蛋白系由肝實質細胞合成， 在血漿中的半壽期約為15-19天，是血漿 中含量最多的蛋白質，占血漿總蛋白的40%-60%，每100ml血漿含3500-5500mg白蛋白。白蛋白在體內的

2、合成率雖然受食物中蛋白質含量的影響， 但主要受血漿 中白蛋白水平調節(jié)， 在肝細胞中沒有儲存，在所有細胞外液中都含有微量的白蛋 白。人血白蛋白的分子結構為含610（585）個氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量 為66458，分子中含17個二硫鍵，不含有糖的組分。在體液pH7.4的環(huán)境中， 白蛋白為負離子，每分子可以帶有200個以上負電荷。人血白蛋白的主要作用：1.增加血容量和維持血漿膠體滲透壓： 白蛋白占血 漿膠體滲透壓的80%，主要調節(jié)組織與血管之間水分的動態(tài)平衡。由于白蛋白分 子量較高， 與鹽類及水分相比， 透過膜內速度較慢， 使白蛋白的膠體滲透壓與毛 細管的靜力壓抗衡，以此維持正常與恒定的血容量

3、；同時在血循環(huán)中，1g白蛋 白可保留18ml水，每5g白蛋白保留循環(huán)內水分的能力約相當于100ml血漿或200ml全血的功能，從而起到增加循環(huán)血容量和維持血漿膠體滲透壓的作用。2.運輸及解毒： 白蛋白能結合陰離子也能結合陽離子， 可以輸送不同的物質， 也可 以將有毒物質輸送到解毒器官。3.營養(yǎng)供給:組織蛋白和血漿蛋白可互相轉化， 在氮代謝障礙時，白蛋白可作為氮源為組織提供營養(yǎng)。主要適應于：1.失血創(chuàng)傷、燒傷引起的休克。2.腦水腫及損傷引起的顱壓升 高。3.肝硬化及腎病引起的水腫或腹水。4.低蛋白血癥的防治。5.新生兒高膽紅 素血癥。6.用于心肺分流術、 燒傷的輔助治療、 血液透析的輔助治療和成

4、人呼吸 窘迫綜合征。制造概要本品系由健康人血漿， 經低溫乙醇蛋白分離法分離純化， 超濾、 除菌過濾、并經60C10小時加溫滅活病毒后制成。1、原料血漿原料血漿的采集及質量隨著國家相關要求的提高變化， 具體改變見 “血液制 品生產用原料血漿（注釋）”22、生產工藝 我國大約在上世紀八十年代中期左右開始血漿蛋白產品的工業(yè)化生產，而人 血白蛋白是最早上市的血液制品之一， 白蛋白的分離純化工藝采用低溫乙醇分級 沉淀分離的方法，到組分V白蛋白的純度達到95鳩上，至怕前為止我國所有的 血液制品廠家仍然采用此方法用于白蛋白的純化生產，從八十年代中期到九十年 代中期，國內的血液制品企業(yè)普遍采用CohnOncl

5、ey的五法或六法用于白蛋白 的分離純化，到九十年代中后期多數(shù)廠家改為Kistler-Nitschmann 法7或及其改良 法，同時將原來的固 -液分離（沉淀分離）由原來的離心方式改為壓濾的方式，到目 前為止，幾乎所有的國內生產企業(yè)都采用此種方式分離純化白蛋白。由于采用低溫 乙醇分離純化工藝，白蛋白溶液中含有較多的乙醇，一般濃度在10%-15%,白蛋白生產的初期， 多采用凍干的方式脫醇， 到了八十年代后期， 超濾技術開始應用 于血液制品的生產， 逐步采用超濾方式替代凍干去除乙醇。 九十年代末期以后我 國的白蛋白生產工藝基本穩(wěn)定。白蛋白的生產過程中， 其核心是分離純化過程， 其中低溫乙醇分離純化工

6、藝 中的一些關鍵參數(shù)對白蛋白的質量有直接影響，如白蛋白的純度，多聚體含量，物理外觀，穩(wěn)定性等，這些關鍵的工藝參數(shù)包括pH,溫度，酒精濃度，離子強 度，蛋白濃度，這五個關鍵參數(shù)在低溫乙醇分離工藝中又稱為“五變因素”，是 最重要的工藝參數(shù)，除此之外，還有乙醇的加入方式，速度，加壓過濾分離時的 壓力，濾過速度等參數(shù)，也對產品的質量有重要影響。（1）原料血漿 原料血漿經低溫乙醇分離純化后可得到白蛋白含量較高的中間組分如組分V沉淀，如經批準該組分可作為中間品凍存，但存放的有效期不得超過批準的規(guī) 定。通常情況下，組分W沉淀是白蛋白分離過程的廢棄組分， 但其中白蛋白含量 可能較高，可用于進一步提取、回收白蛋

7、白，采用組分W沉淀為原料提取白蛋白 時，需采用經批準的特定生產工藝。（2）原液制備原液系指原料經低溫乙醇分級沉淀、 分離純化、 并經超濾去除乙醇后的白蛋 白組分，是人血白蛋白連續(xù)生產過程中的一個階段，通常不作為中間產品保存。（3）半成品為保證人血白蛋白在效期內保存的穩(wěn)定性， 半成品配制時需加入保護劑， 通 常使用辛酸鈉或辛酸鈉和乙酰色氨酸。（4）病毒滅活3白蛋白生產工藝及特定的病毒滅活手段是該制品病毒安全性的重要保證。 白 蛋白制品均采用傳統(tǒng)的巴氏消毒病毒滅活方法，將制品加入保護劑后置60C0.5C水浴中連續(xù)加溫至少10小時，可在制品分裝前或分裝后進行，制品分裝后 進行巴氏消毒可能會使分離純化

8、過程中沒有完全去除的其他蛋白變性，因此制品分裝后進行巴氏消毒對產品的純度要求更高。 如果在分裝前進行， 應防止巴氏消 毒后制品的污染，包括細菌的污染1。經巴氏消毒滅活病毒處理的人血白蛋白在臨床使用的安全紀錄已有幾十年歷史，病毒滅活驗證試驗表明巴氏消毒可有效滅活HIV和相關模擬病毒，WHO 相關指南中描述，將模擬病毒加入5他蛋白溶液中，經60E加溫10分鐘后已檢不出病毒1-4。（5）成品1分裝后孵育自中國生物制品規(guī)程1990年版始，增訂分裝后的制品應置于2035C至少14天孵育，以檢出可能出現(xiàn)的單支染菌制品；中國生物制品規(guī)程2000年版將此項規(guī)定修訂為液體制品分裝后應置2025C至少4周或303

9、2C至少1 4天孵育；在此基礎上， 中國藥典2005年版增訂對不合格制品不能再用于 生產的規(guī)定。 對于檢出的制品如經無菌檢查確證被細菌污染時，應對除菌分裝過程進行回顧性分析，以評估整批制品微生物污染的安全性。2規(guī)格目前批準上市的人血白蛋白規(guī)格有5g/瓶、10g/瓶、12.5g/瓶（5% 10% 20%、25%）（5）重濾和再制2000年版及前面歷版中國生物制品規(guī)程對于無菌檢查及理化檢查不合 格的白蛋白制品允許采用適宜方法再制一次，并根據再制方法增加相應的檢測項 目。為嚴格控制產品質量，自中國藥典2005年版三部開始，取消重濾和再 制的相關規(guī)定。原液檢定中國生物制品規(guī)程1995年版始增訂原液檢定

10、項。殘余乙醇含量：乙醇屬生產過程中使用的有機溶劑，按照中國藥典 2010 年版三部凡例 的相關要求（第二十項，第 1 條）生產過程中采用有機溶劑進行提取、純化時，其殘留量應 符合附錄WV 殘留溶劑測定法的相關規(guī)定。由于人血白蛋白原液的殘余乙醇含量測定，主 要用于控制生產工藝中超濾過程對乙醇的去除， 可采用快速簡便方法， 如康衛(wèi)擴散皿法， 該 法系依據乙醇在飽和碳酸鈉溶液中加熱逸出， 被重鉻酸鉀硫酸溶液吸收后呈黃綠至綠色， 用 比色法測定血液制品中乙醇殘留量該法為乙醇殘余量限度測定法。半成品檢定4熱原檢查：半成品熱原檢查可采用家兔熱原試驗法或細菌內毒素檢查法，一 般情況下，半成品配制以后直接分裝

11、至終容器，通常采用細菌內毒素檢查法以盡 快掌握分裝后制品的內毒素污染情況。 采用細菌內毒素檢查法時， 根據制品濃度 確定細菌內毒素限制應分別小于0.5EU/ml（5%）、0.83EU/ml（10%）1.67EU/ml（20%）2.08EU/ml（25%）。成品檢定成品檢定項目，包括鉀離子含量、白蛋白聚合體、吸收度、熱穩(wěn)定性試驗為 中國生物制品規(guī)程1990年版開始增訂；中國生物制品規(guī)程2000年版增 訂HCV抗體和HIV1/2抗體檢測，之后根據WH對血液制品病毒安全性評估的相 關建議，自中國藥典2005年版三部取消此項檢測。1.鑒別試驗1 995年版中國生物制品規(guī)程開始增加白蛋白鑒別試驗，采用免

12、疫雙擴 散法。中國生物制品規(guī)程2000年版開始增訂免疫電泳法進行白蛋白鑒 別試驗；中國藥典2010年版三部鑒別試驗項 （免疫雙擴散法） 除要求與抗 馬、 抗牛血清不產生沉淀線外增訂與抗豬、抗羊血清或血漿不產生沉淀線； 正常 人血清或血漿作為參考品用于免疫電泳試驗。2.物理檢查（1）不溶性微粒檢查依據中國藥典2010年版三部附錄制劑通則中注射劑項下對溶液型靜脈 用注射液、注射用無菌粉末及注射用濃溶液的要求，人血白蛋白制品成品檢定增訂不溶性微粒檢查。美國藥典USP30-NF25歐洲藥典EP6.0、英國藥典（BP2008版）中對人血白蛋白、靜注人免疫球蛋白的不溶性微粒均未做規(guī)定，但在注射劑項下，不溶

13、性微粒均為必檢項目，檢測方法和標準規(guī)定均與中國藥典2005年版二部附錄相同。以中國藥典2005年版二部附錄為基礎擬定附錄方法。以光阻法測定判 定結果，不符合規(guī)定或供試品不適于用光阻法測定時，應采用顯微計數(shù)法進行測 定，并以顯微計數(shù)法的測定結果作為判定依據，（2）滲透壓摩爾濃度溶液的滲透壓，依賴于溶液中溶質離子的數(shù)量，是溶液的依數(shù)性之一，通 常以滲透壓摩爾濃度（Osmolality）表示，它反映的是溶液中各種溶質對滲透壓 貢獻的總和。血液滲透壓決定血液中細胞膜兩側水份的轉移，正常的血液滲透壓對于維持紅細胞的體積和形態(tài)正常具有重要作用。體外溶血性試驗表明，在等滲 環(huán)境時人血5白蛋白中不含促溶血性物

14、質，對羊血紅細胞、人血紅細胞均不發(fā)生溶 血。脆性試驗（滲透壓改變引起的溶血）表明，當人血白蛋白溶液滲透壓低至140mOsmol/kg時，開始出現(xiàn)溶血。依據中國藥典2010年版三部附錄制劑通則中注射劑項下對靜脈輸液應 按各品種項下的規(guī)定，進行滲透壓摩爾濃度測定并應符合規(guī)定的要求，增訂白蛋白滲透壓摩爾濃度測定，以進一步保證本品臨床使用的安全性和產品質量的批間 一致性。USP30 EP6.0均未規(guī)定白蛋白的滲透壓摩爾濃度，以鉀、鈉離子限度 控制產品滲透壓。采用冰點下降法測定人血白蛋白成品滲透壓。以白蛋白成品中蛋白濃度為5%-25%（滲透壓理論值約為1070 mOsmol/kg）、鈉離子不得過160m

15、mol/L（含 氯化鈉、辛酸鈉，n均以1.84計的滲透壓理論值為294mOsmol/kg計算，本品 滲透壓理論值最大約360mOsmol/kg=考慮到臨床等滲要求，以及已上市人血白 蛋白滲透壓的實際情況，將人血白蛋白成品的滲透壓限度規(guī)定為210400mOsmol/kg。（3）裝量中國藥典2005年版三部開始對人血白蛋白成品增訂裝量檢查，采用標 化的容器測定制品裝量。中國藥典2010年版三部規(guī)定按單劑量供試品裝量 檢查法進行，增加稱重法（密度法）測定裝量。（4）熱穩(wěn)定性試驗1990年版中國生物制品規(guī)程開始對人血白蛋白成品增訂熱穩(wěn)定性試驗，其主要目的在于考察白蛋白生產工藝及其效期內穩(wěn)定性。 除美國

16、藥典 （32版）外、歐洲藥典（6.0版）、英國藥典（？）、日本藥典（？）均無此項要求。3.化學檢定（1）蛋白質含量 按凱氏定氮法的鎢酸沉淀法進行，測定供試品的總氮含量以及經鎢酸沉淀去 除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量， 計算出蛋白質的含量。 根據中國藥典2010年版三部凡例的相關要求以及上市產品的實際情況，增訂蛋白質含量上限 為不高于標示量的110%。（2）純度 采用醋酸纖維素薄膜電泳法測定白蛋白純度，白蛋白在醋酸纖維素薄膜上，在電場的作用下， 帶電粒子按各自的速度向極性相反的電極方向泳動， 使組分分 離成狹窄的區(qū)帶， 經氨基黑或麗春紅染色后， 在色譜掃描儀上紀錄各組分的曲線 圖，以人血清為

17、對照，按峰面積計算白蛋白含量。（ 3）鉀、鈉離子采用火焰光度法測定， 將供試品經霧化為氣溶膠引入火焰光源中， 其中的原 子在火焰6中被激發(fā)而發(fā)射出特定波長的光線，通過光電檢測系統(tǒng)測量出待測元素 特征譜線的強度，以求出供試品中待測元素的含量。 以標準溶液的濃度對其相應 的發(fā)光強度作直線回歸， 將供試品溶液的發(fā)光強度帶入直線回歸方程， 求出待測 元素的含量。（4）人血白蛋白多聚體測定法1990年版中國生物制品規(guī)程開始對人血白蛋白成品增訂多聚體含量測 定，采用Sephadex G-200凝膠柱層析法。1995年版中國生物制品規(guī)程開始 采用高壓液相分子排阻色譜法測定人血白蛋白多聚體含量。以白蛋白單體峰

18、與二 聚體峰計算分離度，應大于1.5,按白蛋白單體峰計算拖尾因子，應為0.951.40 常用色譜柱為親水硅膠高效體積排阻色譜柱（SEC排阻極限300kD,粒度10卩m, 柱直徑7.5mm長60cm；每個樣品分析時間紀錄60分鐘，（因為色譜柱和儀器的 差異保留時間不同,無法固定）按面積歸一法計算,色譜圖中未保留（全排阻） 峰的含量（%）除以2，即為人血白蛋白多聚體含量。（5）辛酸鈉測定法（氣相色譜法）中國生物制品規(guī)程1995年版始，增訂對保護劑辛酸鈉的含量測定并規(guī) 定限值。采用氣相色譜法測定，用酸改性聚乙二醇（20M毛細管柱，火焰離子化檢 測器。辛酸峰與庚酸峰的分離度應大于1.5,辛酸峰的拖尾因

19、子應為0.951.20, 辛酸峰與庚酸峰面積之比的相對標準偏差（RSD應不大于5%。以辛酸對照品 溶液峰面積與內標峰面積比對各辛酸對照品溶液辛酸量（卩g）作直線回歸，求得回歸方程， 計算出供試品辛酸鈉含量。 采用不同廠家的儀器及毛細管柱時， 應適 當調整試驗條件。（6）乙酰色氨酸含量為中國藥典2010年版新增訂檢測項目。采用紫外分光光度法（吸收系數(shù)法），通過測定供試品在280nm處的吸光度，測定人血白蛋白供試品中的N-乙酰-DL-色氨酸含量。（7）鋁殘留量為中國藥典2005年版新增訂檢測項目，檢測方法及限度參照歐洲藥典 的相關規(guī)定（5.0）。人血白蛋白中鋁離子的殘留主要來源于蛋白分離過程中所使

20、用的過濾介質 （如助濾劑、濾材等），以及制品貯存過程中由玻璃分裝容器釋放產生。采用原 子吸收分光光度法測定鋁殘留量， 將供試品原子化產生鋁原子蒸氣， 吸收特征譜 線，通過測定輻射光強度減弱程度，比較對照品和供試品溶液的吸光度， 求出供 試品中鋁含量。74.激肽釋放酶原激活劑（PKA）含量PKA是人血槳中的微量蛋白組分之一，分子量約為35,000,等電點為4.2-4.4。PKA的活性在于通過作用于前激肽釋放酶生成激肽釋放酶，激肽釋放 酶作用于血漿激肽原， 生成活性產物激肽， 激肽是體內的血管舒張物質之一5-6。臨床上快速輸注血液制品可引起病人的血壓下降。 采用低溫乙醇法分離血液制品 時，PKA主

21、要分布在免疫球蛋白等組分中，通常情況下白蛋白中PKA活性較低。自中國生物制品規(guī)程2000年版始，對采用組分W分離的人血白蛋白增 訂PKA活性檢測，限度定為不高于35IU/ml,中國藥典2005年版三部對人血 白蛋白的相關規(guī)定同中國生物制品規(guī)程2000年版一致。為加強對起始原材 料的控制，中國藥典2010年版三部對直接采用血漿生產的人血白蛋白增訂 激肽釋放酶原激活劑含量測定，限度仍為應不高于35IU/ml。激肽釋放酶原激活劑（PKA）含量測定采用顯色底物法（或顯色基質法）。于 供試品中加入前激肽釋放酶（PK，在PKA的作用下生成激肽釋放酶，使顯色基 質S-2302顯色，在特定波長下測定吸光度，將

22、標準品溶液PKA活性的對數(shù)對其 相應的吸光度對數(shù)進行線性回歸，求出回歸方程，代入供試品吸光度計算其PKA活性。5.乙肝表面抗原中國生物制品規(guī)程1990年版始增訂此項檢測， 要求試劑盒靈敏度為3ng/ml以下；中國生物制品規(guī)程1995年版對原料血漿規(guī)程中供血漿者增訂 乙肝疫苗免疫的規(guī)定， 因此在白蛋白成品檢定項下取消此項檢測；為進一步保證 血液制品病毒安全性， 中國生物制品規(guī)程2000年版開始在白蛋白成品檢定 項下再次增訂此項檢測， 同時增訂應為國家藥品當局批準的試劑盒， 以保證試劑 盒的靈敏度和特異性要求。6.異常毒性試驗異常毒性試驗包括豚鼠和小鼠試驗，主要檢測非制品本身引起的動物毒性反 應。

23、 自 中國生物制品規(guī)程1990年版始，小鼠試驗由尾靜脈注射修訂為腹腔 注射。保存、運輸及有效期根據上市批準產品及穩(wěn)定性試驗結果，中國生物制品規(guī)程2000年版增 訂本品可在室溫（30C）下保存和運輸?shù)囊?guī)定；按照統(tǒng)一制定治療類生物制品有 效期起始時間的相關原則，中國藥典2005年版將本品有效期起始時間從血 漿投產之日修訂為分裝之日；在此基礎上中國藥典2010年版將所有生物制 品有效期起始時間統(tǒng)一為自生產之日（半成品8配制之日）起計算。本品可在2-8C或室溫避光保存和運輸，自生產之日（半成品配制之日）起, 有效期為3年或5年，不同保存條件的有效期應根據實際存放條件下的穩(wěn)定性確 定，為保證上市后產品的

24、質量和監(jiān)管，標簽只能規(guī)定一種保存溫度和有效期。使用說明2000年版及以前的歷版中國生物制品規(guī)程均在品種后收載使用說明， 自中國藥典2005年版始，由于治療類生物制品使用說明不再按標準管理， 因此在品種后不再收載相應使用說明。 中國藥典2010年版三部在凡例中規(guī)定， 對于血液制品的使用說明， 要求增加病毒安全性的警示：因生產用原料來自人血，雖然對原料血漿進行了相關病原體的篩查， 并在生產工藝中加入了去除和滅活病 毒的措施， 但理論上仍存在傳播某些已知和未知病原體的潛在風險， 臨床使用時 應權衡利弊。劑型目前上市的人血白蛋白劑型有：人血白蛋白注射液（人血白蛋白）和人血白 蛋白凍干制劑（凍干人血白蛋

25、白），規(guī)格有5g、10g、12.5g（5%、10%、20%、25%）參考文獻（1）Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure theviral safety of human blood plasma products WHOExpert committee on biologicalstandardization Geneva,26 to 30 Nov. 2001（2）Cai K，Gierman T, et al ;Ensuring the Biologic Safety Plasma-Derived TherapeuticProteins. Department of Preclinical Research and Pathogen Safety, Bayer Healthcare LLC,North Carolina, USA. Biodrugs 19（2）:79-96 2005(