光合細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)方法的研究

1、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001-04,32(2):110-112JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2001-04,32(2):110-112光合細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)方法的研究孫軍德,趙春燕,李炳學(xué),王(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué),遼寧沈陽(yáng)110161)壘,陳錫時(shí)摘要:通過(guò)大量試驗(yàn),證明雙層平板法是光合細(xì)菌測(cè)數(shù)的較好方法。它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的測(cè)數(shù)不準(zhǔn)確、操作繁瑣的缺點(diǎn)。通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),確定影響光合細(xì)菌測(cè)數(shù)的4個(gè)主要因素的最佳組合為:底層培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%,烤板時(shí)間為0.5h,上層培養(yǎng)基溫度為50e,上層培養(yǎng)基瓊脂含量為1.0%。關(guān)鍵詞:光合細(xì)菌;雙層平板法;計(jì)數(shù)中圖

2、分類號(hào):Q939.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1000-1700(2001)02-0110-03Double-plateCountingMethodofPhotosyntheticBacteriaSUNJun-de,ZHAOChun-yan,LIBing-xue,WANGLei,CHENXi-shi(ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China)Keywords:photosyntheticbacteria(PSB);double-plate;counting光合細(xì)菌在養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)上的應(yīng)用日益廣泛,近幾年,出現(xiàn)了許多光合細(xì)菌制劑。為確保

3、這類菌劑的質(zhì)量,活菌計(jì)數(shù)極為重要。光合細(xì)菌是兼性厭氧菌,常規(guī)方法采用71培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù),但由于長(zhǎng)時(shí)間光照使培養(yǎng)基表面滲水導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確,操作復(fù)雜且需要特殊的設(shè)備。因此,在原有71配方厭氧罐平板計(jì)數(shù)法基礎(chǔ)上,本研究提出了一種適合光合細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法)雙層平板法,與原有方法相比,這一方法既簡(jiǎn)便又準(zhǔn)確。1#11材料與方法1.1樣品來(lái)源光合細(xì)菌(Rhodopseudomonaspalustris)B9菌液由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供。光合細(xì)菌菌液(蚌埠生物制品廠產(chǎn))和固體菌粉(浙江精科生物公司產(chǎn))從商店購(gòu)得。1.2培養(yǎng)基1.3菌液稀釋采用常規(guī)方法對(duì)菌液稀釋,即用移液管取10mL菌液移于盛有90m

4、L無(wú)菌水的三角瓶中,以此類推,將菌液稀釋至10,10,10。1.4操作步驟取不同稀釋度的光合細(xì)菌菌液(一般為10,10,10)0.1mL均勻涂布于光合細(xì)菌底層固體培養(yǎng)基上,置4550e下烘去水分后,加入冷卻至50e的光合細(xì)菌上層固體培養(yǎng)基15mL,置2830e,8001000lx光照下培養(yǎng)56d,測(cè)定菌落數(shù)。收稿日期:2000-09-04作者簡(jiǎn)介:孫軍德(1963-),男,沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院副教授,碩士,從事微生物學(xué)研究。-6-7-8-6-7-8瓊脂含量為0.8%,另加0.2%酵母膏。其余同71培養(yǎng)基。瓊脂含量為1.0%,另加0.2%酵母膏。其余同71培養(yǎng)基。#p研究報(bào)告RESEARC

5、HREPORT第2期孫軍德等:光合細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)方法的研究#111#此外,半固體試管法試驗(yàn)按參考文獻(xiàn)5,厭氧罐平板計(jì)數(shù)法試驗(yàn)按參考文獻(xiàn)1。1.5光合細(xì)菌雙層平板法培養(yǎng)條件優(yōu)化在各因素單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選定底層培養(yǎng)基的瓊脂含量(A)、烤板時(shí)間(B)、上層培養(yǎng)基溫度(C)及上層培養(yǎng)基瓊脂含量(D)4個(gè)主要因素設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn),所設(shè)4個(gè)因素3個(gè)水平見(jiàn)表1。按正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9(3)表設(shè)計(jì)試驗(yàn),共進(jìn)行了9組試驗(yàn),試驗(yàn)組合見(jiàn)表3。表1各因素水平設(shè)計(jì)Table1ThelevelsoffourfactorsB(H)0.51.02.1結(jié)果與分析雙層平板計(jì)數(shù)法與其他方法比較分別采用半固體試管法、厭氧罐

6、法和本方法測(cè)定同一菌液,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2結(jié)果可以看出,厭氧罐法和半固體試管法所測(cè)得的數(shù)量比雙層平板法要多,且前兩法重復(fù)間誤差較大,重現(xiàn)性不好。這是因?yàn)?厭氧罐法由于長(zhǎng)時(shí)間光照,培養(yǎng)基滲水造成光合細(xì)菌菌落擴(kuò)散,導(dǎo)致所測(cè)定的菌數(shù)增加,重復(fù)性差,甚至導(dǎo)致菌落成片而無(wú)法計(jì)數(shù);而半固體試管法雖解決了培養(yǎng)基滲水問(wèn)題,但由于試管為圓柱體,計(jì)數(shù)過(guò)程中易于造成重復(fù)多次計(jì)數(shù)使所測(cè)得的數(shù)量多于實(shí)際數(shù)。本試驗(yàn)確立的雙層平板法既解決了培養(yǎng)基的滲水問(wèn)題,又使所測(cè)定的菌落處在同一平面上便于觀察計(jì)數(shù),從而使測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確。另外,前兩種方法所用儀器設(shè)備較多,操作比較復(fù)雜。表2光合細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)法與其他方法比較Table

7、2Thecontrastbetweendouble-platewithothercountingmethodsofPSB厭氧罐法Anaerobicculture半固體試管法Semi-solidculture雙層平板法Double-plateculture實(shí)測(cè)平均誤差(%)實(shí)測(cè)平均誤差(%)實(shí)測(cè)平均誤差(%)RecordAverageErrorRecordAverageErrorRecordAverageError2.2光合細(xì)菌雙層平板計(jì)數(shù)方法培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果將9組試驗(yàn)在同一稀釋度的菌數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果見(jiàn)表3,分析值見(jiàn)表中的(1)、(2)、(3)行。根據(jù)各因子分析值的極差可以看出,各因素的影響

8、大小為上層培養(yǎng)基瓊脂含量(D)>底層培養(yǎng)基瓊脂含量(A)>烤板時(shí)間(B)>上層培養(yǎng)基溫度(C)。這說(shuō)明上層培養(yǎng)基瓊脂含量這一因素是主要的,對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果影響最大;而底層培養(yǎng)基瓊脂含量為第二位因素,它與上層培養(yǎng)基瓊脂含量因素的極差相差2.1,說(shuō)明這一因素也很重要,這在實(shí)際測(cè)定中已經(jīng)證明。對(duì)各因素的極差進(jìn)行比較可知,4個(gè)因素相應(yīng)水平的分析值最高的分別為A(2)、B(1)、C(2)、D(1),這說(shuō)明光合細(xì)菌雙層平板法最優(yōu)化的培養(yǎng)條件組合為:底層培養(yǎng)基瓊脂含量為0.8%,烤板時(shí)間為0.5h,上層培養(yǎng)基溫度為50e,上層培養(yǎng)基瓊脂含量為1.0%。p研究報(bào)告RESEARCHREPORT#11

9、2#沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第32卷試驗(yàn)Test123456789分析值(1)Analysis(2)value(3)RTable3ThetesttableoffourfactorsinthreelevelsB烤板時(shí)間C溫度D上層瓊脂含量HouroftoastTemperatureUpperagar菌數(shù)PSBnumber8-1(10#mL)Note:Thevaluesin(1),(2),(3)linesaretheanalysisvaluesofallfactorsinrelevantlevel.Ristherangeofanalysisvalues.3小結(jié)(1)光合細(xì)菌雙層平板法是一種簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)方法,彌補(bǔ)了厭氧罐法和半固體試管法的缺點(diǎn),結(jié)果準(zhǔn)確且操作簡(jiǎn)便。(2)雙層平板法的主要培養(yǎng)條件經(jīng)4因素3水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),確立最優(yōu)培