選擇性鈉氫離子交換抑制劑預(yù)處理對(duì)未成熟心肌的保護(hù)作用

1、選擇性鈉/氫離子交換抑制劑預(yù)處理對(duì)未成熟心肌的保護(hù)作用 作者：周榮華 ，劉斌，劉進(jìn)，關(guān)彬，張艷婉，史世勇，溫福興，龍村 【關(guān)鍵詞】 缺血再灌注損傷 摘要：目的 研究選擇性Na+/H+ 交換抑制劑HOE642（Cariporide）預(yù)處理對(duì)未成熟心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 20只健康新西蘭幼兔（34周齡），利用Langendorff左室做功模型灌注其離體心臟,建立全心缺血/再灌注模型。KH液自主動(dòng)脈逆行灌注心臟，向球囊緩慢注入生理鹽水，調(diào)整至左室舒張末壓（LVEDP）為10mmHg, 做功20 min，隨機(jī)分為兩組，組: 對(duì)照組，繼續(xù)灌注15min；組：HOE642預(yù)處理組，用加

2、入HOE642的KH液（濃度為5mol/L）繼續(xù)灌注15min。然后兩組心臟均以St.Thomas停搏液誘導(dǎo)停跳，常溫（37）缺血45min（保濕保溫），再灌注60 min。記錄冠脈流量（CAF），多導(dǎo)生理記錄儀記錄左心功能指標(biāo)， 原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)鈣（Ca）含量,自動(dòng)生化分析儀測(cè)量冠脈流出液中磷酸肌酸激酶（CK）、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）漏出量含量，計(jì)算心肌含水量，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 CAF、左室發(fā)展壓（LVDP）、左室壓力微分（dp/dtmax）恢復(fù)率，心肌組織內(nèi)Ca 及心肌含水量，心肌超微結(jié)構(gòu)變化，HOE642預(yù)處理組明顯優(yōu)于對(duì)

3、照組（P0.05）。結(jié)論 HOE642預(yù)處理通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，模擬缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)效果，對(duì)未成熟心肌缺血/再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：Na+/H+ 交換;預(yù)處理;未成熟心肌;缺血再灌注損傷;鈣超載Selective Na+/H+ Exchanger Inhibitor HOE642 Preconditioning Exihibits Markedly Protective Effect on Immature Rabbit HeartsAbstract: OBJECTIVE To investigate the protective effect of HOE642 Preco

4、nditioning against ischemia-reperfusion injury on immature myocardium and its mechanisms.METHODS The Langendorff perfused isolated working immature rabbit heart model was established. After perfused by Krebs-Henseleit buffer solusion bubbled with 95%O25%CO2 gas mixture at 70cmH2O for 20min, 20 isola

5、ted hearts of New Zealand healthy white immature rabbits (34 weeks old ,weighing 300g350g) were randomly divided into 2 groups:the group:the control group(n=10)；group:HOE642 preconditioning group(n=10). In group ,the hearts were perfused for 15min by Krebs-Henseleit buffer;In group , HOE642(5mol/L)w

6、as added to Krebs-Henseleit buffer and the hearts were perfused for 15min .Then St.Thomas solution was used ,and all hearts were subjected to 45min global ischemia and 60min reperfusion. Perfusate temperature and ischemic heart temperature were both maintained at 37. Myocardial calcium content was e

7、xamined . Hemodynamicsvariables(LVDP, dp/dt),myocardial water content(WC), coronory artery flow (CAF),leakage of myocardial enzyme(CK,CK-MB,LDH)were also calculated. Myocardial and endothelial structures were observed under election microscope.RESULTS (1)Myocardial function: LVDP, dp/dt, CAF recover

8、y was markedly higher in group than that in group (P0.01 or P0.05). (2) Myocardial calcium content was markedly lower in group (P0.01).(3) Myocardial enzyme is significantly lower in group than group (P0.05).(4)Myocardial water content(WC) was markedly lower in group(P0.01) .(5) Myocardial structure

9、: group was optimal with better protective effect on myocardial structure and endothelium of coronary artery.CONCLUSION HOE642 Preconditioning provide a significantly protection against ischemia-reperfusion injury on immature myocardium, mostly through reducing myocardial calcium overload.Key words：

10、Na+/H+ exchanger; Preconditioning; immature myocardium ;Ischemia-reperfusion injury; Calcium overload隨著心血管外科、體外循環(huán)及圍術(shù)期處理水平的提高，越來(lái)越多的先心病患兒在嬰幼兒期、新生兒期進(jìn)行早期手術(shù)治療。術(shù)中良好的心肌保護(hù)是術(shù)后存活的關(guān)鍵，與未成熟心肌生理功能相適應(yīng)的、有別于成熟心肌保護(hù)措施的尋求是小兒心臟外科關(guān)注的焦點(diǎn)1。這也為將來(lái)胎兒體外循環(huán)的心肌保護(hù)提供依據(jù)。防治心肌缺血/再灌注損傷是心肌保護(hù)的關(guān)鍵，藥物預(yù)處理是防治心肌缺血/再灌注損傷的有效措施。近年,心肌細(xì)胞鈉氫通道（Na+/H+

11、exchanger,NHE1） 介導(dǎo)缺血/再灌注損傷的機(jī)制逐漸受到重視，有研究報(bào)道Na+/H+ 交換抑制劑對(duì)成熟心肌有保護(hù)作用2 。HOE642（cariporide）是第一個(gè)進(jìn)入臨床研究的NHE1拮抗劑，本實(shí)驗(yàn)探討了HOE642預(yù)處理防治未成熟心肌缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制。1材料與方法 1 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器 HOE642（Cariporide）(德國(guó)Aventis Pham公司惠贈(zèng)), Langendorff灌流裝置,Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀（Bridge AD Instrument PTY Ltd, Australia ,Chart v5.0），P-300生理壓力傳感器（北京金三江

12、傳感技術(shù)有限公司），滾壓泵（Stockert,德國(guó)）,混合氣（O2:CO2=95%,北京普萊克斯公司），超純水（SZ-93自動(dòng)雙重純凈水蒸餾器，上海亞容生化儀器廠），Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液（KH液）（mmol/L）:NaCl 118.5、NaHCO3 25.0 、KH2PO4 1.2 、KCL 4.8 、 MgSO47H2O 1.2、 CaCl22H2O 1.8 、葡萄糖11.0 ，pH (7.40.5)。2 建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?健康純種新西蘭大耳白兔，34周齡，雌雄不限，體重300350g（阜外心血管病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。以戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔麻醉，經(jīng)耳緣靜脈

13、肝素化（150IU/kg）,由劍突剪開(kāi)胸腔，迅速剪開(kāi)壁層心包，快速摘取心臟并浸入4KH液中，主動(dòng)脈修剪及輕擠心臟排盡心腔余血后立即將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，用恒溫循環(huán)器預(yù)先恒溫到37、95%O2+5%CO2混合氣平衡20min的KH液，自主動(dòng)脈根部逆行灌注心臟，冠脈流出液不參與循環(huán)，主動(dòng)脈灌注壓（CPP）為70 cmH2O，剪開(kāi)肺動(dòng)脈根部以利冠脈回流通暢。剪開(kāi)左心耳,將與多道生理記錄儀相連的小乳膠囊經(jīng)左心耳放于左室，通過(guò)Powerlab壓力換能器的換能作用，多道生理記錄儀能記錄心臟左室功能參數(shù)：左室發(fā)展壓（LVDP）、左室壓力微分（dp/dtmax）。向球囊緩慢注入生理鹽水

14、，調(diào)整至左室舒張末壓（LVEDP）為10mmHg，建立左室做功模型。3實(shí)驗(yàn)分組 37KH液平衡灌注心臟，做功20 min，將20枚幼兔心臟隨機(jī)分為兩組，組:對(duì)照組, 繼續(xù)灌注15min； 組：HOE642預(yù)處理組，用加入HOE642的KH液（濃度為5mol/L）繼續(xù)灌注15min。兩組心臟均以常溫St.Thomas停搏液20ml誘導(dǎo)停跳（灌注壓為80 cmH2O），常溫（37）缺血45min（保濕保溫），再灌注60 min，建立全心缺血/再灌注模型。 4 監(jiān)測(cè)指標(biāo) 心臟做功20 min時(shí)，記錄冠脈（CAF）、 LVDP、dp/dtmax作為基礎(chǔ)值，再分別記錄其再灌注10min、30min、60

15、min測(cè)定值，計(jì)算其對(duì)基礎(chǔ)值的恢復(fù)率。取再灌注5 min的冠脈流出液，以自動(dòng)生化分析儀測(cè)定磷酸肌酸激酶（CK）漏出量、磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）漏出量。再灌注畢，快速取下心臟，濾紙吸盡心臟表面水分，取心尖部心肌置于戊二醛固定做透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。切取左室 心肌，電子天平（精度110-5）稱量心肌濕重，置于60烘箱烘烤24h后稱量其干重，心肌含水量為（1-干重/濕重）100%，以百分比表示。留取干標(biāo)本，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)鈣含量（Ca）。5 數(shù)據(jù)表達(dá)和統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)均以s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較采用t檢驗(yàn), P0.05為組

16、間差異有顯著性意義，P0.01為差異有非常顯著性意義。2 結(jié)果2.1 基礎(chǔ)值及恢復(fù)率 心臟做功20 min時(shí)，兩組心功能的基礎(chǔ)值和冠脈流量測(cè)定結(jié)果比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。再灌注后10 min、30min 、60min，組的LVDP、 dp/dtmax的恢復(fù)率較組顯著性增高（P0.05 或P0.01）。見(jiàn)表1。表1 兩組心功能缺血前基礎(chǔ)值及再灌注10min、30min、60min恢復(fù)率（略）注：與同時(shí)點(diǎn)組比較 * P0.05，* *P0.012.2心肌酶 再灌注5min后冠脈流出液中心肌酶值于組較組明顯降低（P0.05 或P0.01），見(jiàn)圖1。2.3 心肌細(xì)胞鈣含量 見(jiàn)圖1。組細(xì)胞內(nèi)含鈣量(9.93.

17、4mol/g.dry wt)明顯低于組（16.44.8mol/g.dry wt）（P0.01）。 4 心肌細(xì)胞內(nèi)含水量 組、組心肌細(xì)胞內(nèi)含水量分別為85.（416.1）%、（82.37.5）%，組明顯低于組（P0.01）。2.5心肌組織透射電鏡 觀察結(jié)果見(jiàn)圖2,3。組（圖2）：肌節(jié)長(zhǎng)短不一，肌原纖維排列紊亂，收縮不規(guī)則；心肌細(xì)胞灶性肌漿凝集、灶性肌絲溶解壞死，有大泡形成；多數(shù)線粒體腫脹、空泡化，線粒體嵴斷裂，嵴減少；肌漿網(wǎng)擴(kuò)張、空泡化；細(xì)胞核染色質(zhì)凝集；糖原顆粒明顯減少；內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯。組（圖3）：肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肌節(jié)清晰，I帶、A帶、M線、Z線清晰，少數(shù)肌絲灶性溶解；線粒體無(wú)腫脹，嵴清晰；

18、少數(shù)肌漿網(wǎng)擴(kuò)張；糖原顆粒較組明顯多。3討論預(yù)處理是防治缺血/再灌注損傷的重要措施，可分為缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning ,IPC）和藥物預(yù)處理。IPC往往具有一定的致?lián)p性，臨床應(yīng)用是通過(guò)對(duì)IPC保護(hù)機(jī)制的理解，利用能激動(dòng)IPC信號(hào)傳導(dǎo)某一階段的藥物來(lái)模擬其作用。IPC對(duì)心肌保護(hù)機(jī)制可歸納為內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放和離子及離子通道的變化，其中缺血/再灌注期間有害Ca2+內(nèi)流的減少是一重要途徑3。Ca2+是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮和舒張所必須的因素。心肌細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度主要由肌漿網(wǎng)、線粒體、質(zhì)膜上鈣泵的調(diào)節(jié)來(lái)維持其動(dòng)態(tài)平衡。在成熟心肌，胞漿中Ca2+濃度主要靠肌漿網(wǎng)的釋放與隔

19、離作用來(lái)調(diào)節(jié)。未成熟心肌細(xì)胞鈣調(diào)節(jié)系統(tǒng)尚未成熟，肌漿網(wǎng)稀疏，鈣泵活性低，但其質(zhì)膜面積和細(xì)胞容積之比值較大，鈣通道數(shù)量及敏感性較成熟心肌高，與成熟心肌相比，未成熟心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的維持和調(diào)節(jié)更依賴于質(zhì)膜上鈣通道數(shù)量及敏感性1。傳統(tǒng)的鈣通道阻斷劑通過(guò)阻斷質(zhì)膜上慢鈣通道使細(xì)胞外鈣的內(nèi)流減少，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，對(duì)成熟心肌有明顯的保護(hù)作用，然而對(duì)未成熟心肌則會(huì)因?yàn)闇p少質(zhì)膜上鈣通道數(shù)量及降低其活性而引起心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+降低，導(dǎo)致心肌收縮功能下降。固此，針對(duì)未成熟心肌缺血再灌注時(shí)鈣超載，有必要尋找傳統(tǒng)鈣通道阻斷劑以外的能減輕鈣超載藥物。哺乳動(dòng)物鈉氫通道4（Na+/H+ exchanger,NHE）有

20、7種亞型，分別稱之為NHE17，而存在心肌細(xì)胞主要是NHE1，NHE1每排出一個(gè)H+就有一個(gè)Na+進(jìn)入細(xì)胞。在正常情況下，心肌細(xì)胞NHE1 對(duì)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)pH和細(xì)胞內(nèi)Na+濃度具有十分重要的作用。當(dāng)心肌細(xì)胞缺血時(shí)，糖酵解增加，產(chǎn)生大量H+，細(xì)胞內(nèi)酸度提高，NHE1被激活；再灌注時(shí)，細(xì)胞外液H+濃度迅速下降，造成細(xì)胞內(nèi)外H+濃度梯度增大，這會(huì)再度激活NHE1。NHE1激活后，大量Na+流入細(xì)胞內(nèi)，pHi 迅速恢復(fù)；與之伴隨的是細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高及細(xì)胞腫脹，Na+跨質(zhì)膜梯度降低和pHi 的升高又迅速 使Na+/K+-ATP酶和Na+-Ca2+通道激活，以便更好地清出細(xì)胞內(nèi)過(guò)高的Na+4,5；由

21、于心肌缺血時(shí)ATP合成減少，Na+/K+-ATP酶活性降低，無(wú)法通過(guò)正常的Na+/K+交換將過(guò)多的Na+排出細(xì)胞外，Na+-Ca2+交換便活躍起來(lái)5。Na+-Ca2+通道以3個(gè)Na+交換1個(gè)Ca2+的方式進(jìn)行， 引起Ca2+內(nèi)流增加，最終造成心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超負(fù)荷 。正常心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)主要依靠質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) /肌漿網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、線粒體鈣轉(zhuǎn)移系統(tǒng)5。質(zhì)膜上有兩個(gè)鈣通道：高親和力低容量的Ca2+泵（Ca2+-Mg2+ATP酶）和低親和力高容量的Na+-Ca2+通道，前者需要分解1分子ATP。未成熟心肌肌漿網(wǎng)稀疏，肌漿網(wǎng)鈣攝取與釋放功能在缺血再灌注損傷鈣超載機(jī)制中不起主要作用1；而缺血再灌注期，ATP合成減少，Ca2+-Mg2+ ATP酶 活性受到抑制，故NHE1激活這一始動(dòng)環(huán)節(jié)是激活Na+-Ca2+通道從而導(dǎo)致未成熟心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載的重要途徑。鑒于未成熟心肌細(xì)胞糖原顆粒含量豐富和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)1，特異性NHE1抑制劑抑制NHE1的激活，間接地抑制質(zhì)膜上Na+/Ca2+交換，既能防治鈣超載，又不影響質(zhì)膜上未成熟心肌鈣泵數(shù)量和活性，理論上是未成熟心肌保護(hù)的理想的藥物，但尚無(wú)研究深入證實(shí)這一點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，NHE1拮抗劑HOE642預(yù)處理能模擬