豬脾轉移因子的制備及臨床應用_喬宏興

1、豬脾轉移因子的制備及臨床應用喬宏興 , 白靜(鄭州牧業(yè)工程高等專科學 校 , 河南鄭州 450011摘要 :本試驗采用透析法提取豬脾轉移因子 (T F , 并對其理化性質 、 生物活性 、 安全性進行了研究 。 結果表明 , T F 可增 強 小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能 , 體外抑菌結果 顯示金黃色 葡萄球 菌 、 大 腸桿菌 、 沙 門氏菌 對轉移因 子敏感 , 而 鏈球菌 不敏感 。 對豬流行性腹瀉 、 豬傳染性 胃腸炎分別使用 T F (0. 2、 0. 1、 0. 05mL /kg 和藥物進行治療 , 結果表明使用 0. 1mL /kg T F 的劑量 效果較好 。關鍵詞 :轉移因子

2、; 巨噬細胞 ; 抑菌中圖分類號 :S852. 4 文獻標識碼 :A 文章編號 :1671-7236(2011 07-0203-03 轉移因子 (transfer facto r , TF 是從致 敏淋巴 細胞中提取的一種可溶性不耐熱的小分子肽 , 分子 質量為 35005000, 56 30min 可滅活 , 低溫保存 數(shù)年活性不消失 。 具有傳遞特 異性細胞免疫 的作 用 , 還能非特異地增強 一般細胞免疫作用 (馮 來坤 等 , 1999 。 轉移因子的作用發(fā)生迅速 , 維持時間也 較長 , 可達數(shù)月至一年以上 。 由于轉移因子是小分 子成分 , 無抗原性 , 長期應用機體也不產(chǎn)生抗體

3、。 近 年來研究證明 , 轉移因 子作用無種屬特異 性 (蔡琳 昌 , 1990 , 生化指標 、 生物活性及臨床效果均與人轉 移因子相似 , 且無毒 , 不引起過敏反應 。 因此 , 可利 用豬脾制備 , 河南是養(yǎng)豬大省 , 每年屠宰數(shù)量巨大 , 所產(chǎn)生的豬的廢棄物脾臟數(shù)量也很大 , 可以將豬的 脾臟變廢為寶 , 提取生物制品 。 作者對豬脾轉移因 子的制備 、 活性檢測 、 免疫特性及在臨床上的應用等 進行了研究 , 以供于獸醫(yī)臨床使用提供依據(jù) 。收稿日期 :2010-12-09作者簡介 :喬宏興 (1976- , 男 , 河 南人 , 講師 , 碩士 , 研 究方向 :動物免疫學 、 預

4、防獸醫(yī)學 ?；痦椖?:河南省教育廳項目 (2009A230006 。 1 材料與方法1. 1 材料 豬脾臟 , 由鄭州肉聯(lián)廠提供 ; 試劑 :雙蒸 水 、 1%雞紅細胞 、 可溶性淀粉由鄭州牧業(yè)工程高等 ?？茖W校微生物教 研室提供 ; 儀器 :高 速組織搗碎 機 、 低溫冰柜 、 離心機 、 透析袋 、 紫外分光光度計等 ; 試驗動 物 :小 白鼠 , 購于 鄭州大 學實 驗動物 中心 。 豬 , 購于河南某豬場 。1. 2 方法1. 2. 1 透析法制備 將凍存的豬脾臟取出融化 , 去 脂肪 、 被膜 , 充分洗凈 。 用組織搗碎機絞碎 , 加適量生 理鹽水后 , 用高速組織搗碎機高速 (

5、12000r /min 勻漿 2次 , 每次 1min 。 將勻漿置 -20 反復凍融 3次 。 最后一次融化后以 3000r /min 離心 30min , 取上清 , 將上清置透析袋內 , 用無熱原的冷生理鹽水在 0 4 環(huán)境下透析過夜 , 收集袋外透析液即為制備的轉 移因子 (張萍等 , 2007 。 -20 保存?zhèn)溆?。1. 2. 2 豬脾轉移因子理化性質檢驗 按分光光度法 測定 , 在 (2511 nm 處有最大吸收度 , 紫外光光度 計測定 260nm 與 280nm 比值 ; 取 2mL 加入適量茚 三酮溶液 , 加熱后進行反應 。1. 2. 3 安全試驗 取小白鼠 40只 ,

6、分成 1、 2、 3、 4組 ,(1. Co llege of Animal Science and Veterinary M edicine , Qingdao Ag ricultural University , Qingdao 266109, China ;2. College of Haidu , Qingdao Ag ricultural University , Laiyang 265200, China ;3. Veterinary Station in Guandao Town , Qixia 265316, China A bstra ct :T he susceptibil

7、ity test of F lorfenico l and O xytetracycline Hy drochloride o n six strains of Escherichia coli and Salmonella was car ried out by the broth dilution checkerboard method in o rder to study the combined antibacterial effect in clinical application in vitro . T he results suggested that the MIC of s

8、ingle drug o n the standard strains of Escherichia coli and Salmonella was 1to 8g /mL , on the clinical strains was 64to 128g /mL . T he FIC of drug combination w as 0. 5, 0. 75, 1. 5, 0. 5, 0. 75, 1. 0; there were four strains appeared additive effect while the other two strains appeared synergisti

9、c and irrelevant effect .Key words :Flo rfenicol ; O xy tetr acy cline H ydro chloride ; drug combinatio n每組 10只 , 第 4組為對照組 , 第 1、 2、 3組分別經(jīng)尾靜 脈注射 0. 1、 0. 15、 0. 2m L , 對照組注射生理鹽水 0. 2mL , 連續(xù) 7d 觀察小白鼠反應 , 48h 內不得有死亡 。 1. 2. 4 無菌檢驗 取本品分別接種到普通瓊脂培 養(yǎng)基 、 厭氧培養(yǎng)基及馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上 , 37 培養(yǎng) 1周 , 觀察有無需氧菌 、 厭氧菌 、 霉菌生

10、長 。 1. 2. 5 小白鼠巨噬細胞吞噬功能試驗 取成年雄 性小白鼠 40只 , 隨機分成 4組 , 第 1組為低劑量轉 移因子 組 (每 只 小 白 鼠 腹 腔 注 射 自 制 轉 移 因 子 0. 5mL , 第 2組為中等劑量轉移因子組 (1mL /只 , 第 3組為高劑量轉移因子組 (2mL /只 , 第 4組為對 照組 , 注射等量生理鹽水 ; 間隔 24h 后 , 取可溶性淀 粉少許加入蒸餾水中 , 煮沸冷卻后 , 每只小白鼠腹腔 注射 1mL ; 再間隔 2h 后 , 取 1%雞紅細胞懸液每只 小白鼠注射 1m L 。 2h 后 , 從腹腔抽取滲出液 , 滴于 載玻片上 , 用

11、蓋玻片推成薄片 , 晾干后用美蘭染色液 染色 , 油鏡下觀察 。 計數(shù) 100個巨噬細胞中吞噬雞紅 細胞的巨噬細胞為吞噬百分數(shù) ; 100個巨噬 細胞中 平均每個巨噬細胞吞噬的雞紅細胞數(shù)為吞噬指數(shù) 。 1. 2. 6 體外抑菌試驗 按劉湘新等 (2005 介紹的方法進行操作 , 按一般制備培養(yǎng)基方法無菌培養(yǎng)金 黃色葡萄球菌 、 大腸桿菌 、 沙門氏菌 、 鏈球菌 。 將無菌圓形濾紙片浸泡于制備的轉移因子中 2h , 制備 成轉移因子濾紙片 , 然后分別對金黃色葡萄球菌 、 大 腸桿菌 、 沙門氏菌 、 鏈球菌進行抑菌試驗操作 , 置于 37 溫箱中 24h , 觀察抑菌圈的大小 。1. 2.

12、7 TF 的臨床治療試驗 選取河南兩個發(fā)病 豬場 , 經(jīng)診斷為流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的病豬 各 100頭和 60頭 , 兩群豬分別隨機分為 3個試驗組 和 1個對照組 , 分別為 、 、 組 , 依次分別使用 TF (0. 2、 0. 1、 0. 05m L /kg 的劑量進行治 療 , 兩群 豬對照組使用氟本尼考 +阿托品 , 觀察轉移因子的 治療效果 。 2 結果2. 1 物理性狀和理化性質 轉移因子制備出來后 呈淡黃色 透 明 液體 。 紫外 光 光 度 計 測定 A 260nm /A 280nm =2. 18, 符合要求 。 加入適量茚三酮溶液 , 加 熱后呈紫色 。2. 2 安全試

13、驗 由表 1可知 , 注射不同劑量的轉移 因子無任何副作用 , 安全 , 可以在臨床中使用 。表 1 豬脾轉移因子安全試驗組別1234數(shù)量 (只 20202020注射劑量 TF 0. 1m L /只 TF 0. 15m L /只 TF 0. 2m L /只 生理鹽水 0. 2m L /只安全反應無任何副反應無任何副反應無任何副反應無任何副反應2. 3 小白鼠巨噬細胞吞噬功能試驗 結果表明 , 注 射轉移因子后小白鼠腹腔巨噬細胞的百分率和吞噬 指數(shù)與對照組相比 , 均有明顯提高 , 差異顯著 (P 0. 05 , 結果見圖 1和圖 2。 由圖 1、 圖 2可知 , 低劑 量組 、 中等劑量組 、

14、 高劑量組注射 TF 小鼠腹腔巨噬 細胞吞 噬雞 紅 細胞 的 百分 率極 顯 著 高于 對 照 組 (P 0. 01 , 表明 TF 能夠顯著 提高小白鼠腹 腔巨 噬細胞吞噬功能 , 3組劑量相比 , 中等劑量顯示較高 的吞噬功能 。圖 1 TF 對小白鼠巨噬細胞 吞噬百分率的影響圖 2 TF 對小白鼠巨 噬細胞吞噬指數(shù)的影響2. 4 體外抑菌試驗 試驗結果見表 2。 結果表明 金黃色葡萄球菌 、 大腸桿菌 、 沙門氏菌對轉移因子比 較敏感 , 而鏈球菌不敏感 (判定標準為抑菌圈直徑大于 11m m 判為敏感 , 小于 11m m 判為不敏感 。表 2 轉移因子體外抑菌試驗結果菌株抑菌圈直徑

15、 (mm 金黃色葡萄球菌 261. 3大腸桿菌 422. 1沙門氏菌391. 7鏈球菌101. 82. 5 TF 的 臨床治療效果 豬脾轉移因子 的臨床 治療效果見表 3。 由表 3可知 , 使用 TF 進行治療 , 其臨床治療效果明顯高于對照組 , 而在 、 組治療 過程中 , 區(qū)別不大 。表 3 TF 的臨床治療效果劑量流行性腹瀉 傳染性胃腸炎頭數(shù) 治愈數(shù) 治愈率 (% 頭數(shù) 治愈數(shù) 治愈率 (% 組 252288151280 組 252288151173 組 25208015853對照組 25176815640 3 討論在制備豬脾轉移因子時 , 所用臟器應新鮮 , 勻漿 時應徹底搗碎 ,

16、 反復凍融 , 以便使轉移因子有效成分 充分釋放 。 此種透析方法簡便 、 低廉 、 易于操作 , 不 需要特殊的設備和器材 。 轉移因子常溫下易喪失活 性 , 因此 , 有關操作 (如透析 應在低溫下進行 。 常溫 下的各種操作均應快捷迅速 。 各步所用蒸餾水均應 無熱原 , 保證提取后的轉移因子的安全性 。機體免疫系統(tǒng)分為非特異性免疫系統(tǒng)和特異性 免疫系統(tǒng) , 當特異性免疫系統(tǒng)不能發(fā)揮作用的時候 , 機體主要依靠自身的非特異性免疫力抵抗病原微生 物的感染 。 巨噬細胞是體內吞噬病原微生物的重要 細胞之一 , 在炎癥 、 感染和抗腫瘤等許多方面起到重 要作用 (金伯泉 , 2003 。 因此

17、巨噬細胞吞噬功能的 增強可以作為衡量機體非特異性免疫力的高低 。 當 有異體物質進入到體內后 , 動物機體會發(fā)動體內所 有的巨噬細胞向其靠攏 , 給小白鼠注射雞的紅細胞 可以觀察吞噬細胞 的吞噬能力 。 體內試驗結 果顯 示 , 小白鼠注射轉移因子后能明顯提高巨噬細胞的 吞噬能力 , 其中 , 中等劑量組的吞噬功能最強 , 而低 劑量組和高劑量組的吞噬功能低于中等劑量組 , 原 因可能在于低劑量組不能充分發(fā)揮 TF 的作用 , 而 高劑量組在于過多的注射劑量會導致動物機體應激 反應的發(fā)生 , 從而降低了 TF 的作用 , 具體原因仍需 進一步研究 。 TF 增強動 物的吞噬功能 , 這對于控

18、制臨床中的一些常見疾病 、 免疫抑制性疾病 (如流行 性腹瀉 、 傳染性胃腸炎 、 豬瘟 、 豬繁殖與呼吸綜合征 、 圓環(huán)病毒病 具有重要意義 。體外抑菌試驗結果表明 , 轉移因子對金黃色葡 萄球菌 、 大腸桿菌 、 沙門氏菌具有明顯的抑菌作用 , 說明轉移因子對細菌病的預防和治療也能起到一定 的作用 , 但對鏈球菌的抑制作用并不非常敏感 , 有待 于進一步研究 。TF 的臨床治療效果顯示 , 添加轉 移因子的治 療組明顯高于對照組 , 在治療組中 , 使用中等劑量和 高劑量效果基本上無多大區(qū)別 , 而比小劑量效果較 好 , 由此可知 , 添加中等劑量的轉移因子可提高治療 效果 。 目前臨床上

19、一些疾病產(chǎn)生免疫抑制 , 不但引 起本病的發(fā)生 , 同時導致其他已接種疫苗的免疫應 答水平降低 , 導致疾病的混合感染 , 對于這些疾病 , 使用 TF 進行治療能起到比較好 的效果 , 對 于 TF 如何提高其免疫能力 , 使用轉移因子能否提高疫苗 的抗體水平等仍需進一步研究 。參 考 文 獻1 孔慶波 , 陳進軍 , 常建軍 , 等 . 豬轉 移因子對 犬中性粒 細胞數(shù)量 和 活性的影響 J . 中國畜牧獸醫(yī) , 2008, 35(1 :4751.2 馮來坤 , 黃超英 , 楊洪群 , 等 . 轉移 因子口服 給藥國內 外研究進 展 J . 中國生化藥物雜志 , 1999, 20(5 :2

20、62263.3 劉湘新 , 劉進 輝 , 何 湘蓉 , 等 . 轉移 因子 的制 備與 生物 活 性研 究 J . 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志 , 2005(6 :3335.4 張萍 , 馬春全 , 李冬紅 , 等 . 豬脾轉 移因子的 制備及其 活性的檢 測 J . 黑龍江八一農(nóng)墾大學學報 , 2007, 19(3 :6871.5 金伯泉 . 細 胞和 分 子免 疫學 M . 第 2版 . 北京 :科 學出 版 社 , 2003, 134137.6 蔡琳昌 . 豬脾轉移因子的制 備及質量 控制 C . 第四屆 全國轉 移 因子學術討論會論文集 . 北京 :中國科學技術出版社 , 1990:158 161.Preparation and Therapeutically Application forTransfer Factor of Porcine S pleenQ IAO H ong -xing , BAI Jing(Z heng zhou College o f A nimal H usbandry and V eterina ry Engineering , Z heng z