電離輻射相關(guān)低密度寡核苷酸基因芯片的制備

1、    作者：郭萬峰，王升啟，黃堅(jiān)，郭國禎 【關(guān)鍵詞】  肺癌    Fabrication of lowdensity ionizing radiationrelated oligonucleotide microarray【Abstract】 AIM: To fabricate an oligonucleotide microarray applied to ionizing radiation. METHODS:  According to the genes reported previ

2、ously in radiation responses and their family genes or related genes, oligonucleotide microarray was designed. mRNA sequences of these genes were obtained from the GenBank. Specific probes were designed with Mprobe software and synthesized by AB18909 DNA synthesis system and spotted onto aldehydecoa

3、ted glass slides using Cartesian Pix sys 3000 spotter in our laboratory. Using this microarray, we identified genes showing altered expression in different radiosensitive lung cancer cell lines. To provide independent confirmation of microarray data, semiquantitative RTPCR was performed on four gene

4、s. RESULTS:  Lowdensity radiationrelated oligonucleotide microarray was fabricated successfully, which had 143 genes including 127 involved in stress response, cell cycle progression, DNA damage and repair, apoptosis and proliferation, together with 11 housekeeping genes and 3 luciferase g

5、enes as positive controls and 2 rice genes as negative controls. Eighteen differentially expressed genes were screened by this microarray. Four genes were detected by RTPCR, and the results were in accordance with those from the microarray data, even though the value for each mRNA level might be dif

6、ferent between the two measurements. CONCLUSION:  The radiationrelated oligonucleotide microarray can be used to investigate the differentially expressed genes in different radiosensitive cancer cells and provide a platform for radiation research.【Keywords】 microarray; ionizing radiation;

7、lung neoplasms; cell line, tumor【摘要】 目的: 構(gòu)建一種適用于輻射研究領(lǐng)域的低密度寡核苷酸基因芯片. 方法: 根據(jù)以往的研究報(bào)告，篩選參與輻射生物效應(yīng)的基因和相關(guān)基因，從GenBank獲取mRNA序列，使用Mprobe軟件設(shè)計(jì)特異的探針，構(gòu)建低密度輻射相關(guān)的基因芯片.在不同輻射敏感性肺癌細(xì)胞系中對該芯片的靈敏度和特異性進(jìn)行評價(jià)，并對一些差異表達(dá)基因進(jìn)行RTPCR驗(yàn)證，以確認(rèn)芯片檢測結(jié)果的可信性. 結(jié)果: 構(gòu)建出了輻射相關(guān)的寡核苷酸基因芯片,該芯片共含有143個(gè)基因,即127個(gè)輻射相關(guān)基因和16個(gè)對照基因.在不同輻射敏感性的A549和NCIH446細(xì)胞中，篩選出

8、18個(gè)差異表達(dá)基因.經(jīng)RTPCR對4個(gè)基因的驗(yàn)證,結(jié)果與芯片資料較一致. 結(jié)論: 輻射相關(guān)低密度寡核苷酸基因芯片可以檢測不同輻射敏感性腫瘤細(xì)胞的差異表達(dá)基因, 為輻射領(lǐng)域的研究提供了一種技術(shù)平臺.【關(guān)鍵詞】 基因芯片；電離輻射； 肺癌;腫瘤細(xì)胞系0引言基因芯片技術(shù)作為一門新興的技術(shù)，具有高通量、微型化和自動化的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于各種組織的表達(dá)譜分析1-2.近年來也逐漸被應(yīng)用于檢測輻射誘導(dǎo)的相關(guān)基因3-5.然而，高密度芯片針對性不強(qiáng)，產(chǎn)生過于繁雜的實(shí)驗(yàn)資料，不利于分析并且耗時(shí)費(fèi)力，需要較多的資金，不是一般的實(shí)驗(yàn)室所能進(jìn)行的.我們系統(tǒng)的比較了不同技術(shù)平臺的基因芯片的優(yōu)缺點(diǎn)后6構(gòu)建了一種適用于輻射研

9、究領(lǐng)域的低密度寡核苷酸基因芯片.1材料和方法1.1材料肺腺癌細(xì)胞A549和肺小細(xì)胞癌細(xì)胞NCIH446(本室保存). 60Co源由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供. SuperScriptTM II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司);Cy3dUTP/Cy5dUTP(Amersham公司);RNasin (Promega公司);dNTPs (Invitrogen公司); ImPromIITM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega公司);引物為實(shí)驗(yàn)室自行合成（表1）.表1PCR引物（略）1.2方法1.2.1輻射相關(guān)基因的選擇及芯片設(shè)計(jì)根據(jù)輻射生物學(xué)效應(yīng)和國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)，選擇了部分與輻射效應(yīng)相關(guān)的人類細(xì)胞凋亡基因、細(xì)胞周

10、期基因、DNA損傷修復(fù)基因、應(yīng)激信號途徑基因作為候選基因.芯片質(zhì)控采用定量陽性對照和定量內(nèi)標(biāo)看家基因、陰性對照，對逆轉(zhuǎn)錄、雜交過程進(jìn)行檢測和結(jié)果分析.芯片包括143個(gè)基因，其中含定量陽性對照熒光素酶基因3個(gè)基因，定量內(nèi)標(biāo)看家基因11種（aldolase B,ribosomal protein S28,malate dehydrogenase 2, SDHC, 23 kd highly basic protein, ribosomal protein S9, tubulin, actin, ribosomal protein L32, GAPDH和ALB），陰性對照為兩種水稻EST序列（AU18

11、2426和AU182425）.1.2.2寡核苷酸芯片的制備從GenBank中查詢所有候選基因的mRNA序列，用大規(guī)模寡核苷酸探針設(shè)計(jì)軟件Mprobe進(jìn)行探針設(shè)計(jì)7，探針長度為40nt，GC含量4555，自身無二級結(jié)構(gòu). BLAST分析，篩選出基因特異的寡核苷酸探針. 在AB18909 DNA合成儀上進(jìn)行寡核苷酸的合成.采用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰氨化學(xué)方法,5或3氨基修飾用NMMTr6氨己基2氰乙基N,N 二異丙基亞磷酰氨(自制),在合成后的最后一步引入.合成完畢后濃氨水55脫保護(hù)/切割15 h,OPC柱純化.分光光度計(jì)DU640檢測寡核苷酸探針的濃度，用3×SSC稀釋成0.5 g/L.用Pix

12、sys 7500芯片制備儀將寡核苷酸點(diǎn)到醛基片上，放置過夜，晾干備用.1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及照射取本室保存的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和肺小細(xì)胞癌NCIH446，培養(yǎng)于含有100 mL/L小牛血清和1×105 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37，50 mL/L CO2的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng).60Co射線照射, 吸收劑量率為1.511.68 Gy/min.1.2.4肺癌細(xì)胞總RNA的提取和熒光標(biāo)記cDNA的合成用Trizol（Invitrogen life technologies）試劑盒按說明書推薦的操作步驟提取細(xì)胞總RNA.用紫外分析和甲醛變性電泳，分析其

13、純度和完整性.然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄熒光標(biāo)記，兩種細(xì)胞的總RNA分別用不同的熒光（Cy3和Cy5）標(biāo)記，具體方法為：總RNA 50 g，Oligo dT16 1.25 L，定量陽性對照熒光素酶體外轉(zhuǎn)錄mRNA 0.15 L，RNasin 0.2 L，混勻，70 溫育10 min，冰上冷卻.然后加入第一鏈5×Buffer 2.5 L，DTT 1.25 L，MixdNTP 0.5 L，Cy3/Cy5dUTP 0.5 L，RNasin 0.3 L，Superscript II 0.5 L，42水浴2 h.最后用NaOH 65處理3060 min，進(jìn)行堿變性.乙醇沉淀標(biāo)記的cDNA.1.2.5基因芯

14、片的雜交和洗滌按照13的比例將標(biāo)記的cDNA與雜交液（500 mLL甲酰胺，5×Denhardt液，6×SSC，5 g/L SDS）混勻，將樣品加在基因芯片上，42雜交3 h.雜交完畢后，分別用1×SSC+2 g/L SDS，0.2×SSC和0.1×SSC洗滌5 min.1.2.6差異表達(dá)基因的檢測和分析用ScanArray 4000掃描芯片，用GenePix Pro4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和歸一化處理. 使用看家基因和陽性對照對Cy3和Cy5掃描結(jié)果進(jìn)行校正，以Cy5和Cy3的熒光強(qiáng)度值-背景值>400和Cy5/Cy3的比值>1.5

15、或1.5, 5S RNA條帶不明顯,證明獲得了高純度、高完整性的總RNA.2.2輻射相關(guān)基因芯片的雜交使用該芯片對A549和NCIH446細(xì)胞的樣本進(jìn)行雜交，輻射相關(guān)基因芯片的雜交結(jié)果見圖1，芯片為286個(gè)點(diǎn)，143個(gè)基因，每個(gè)基因兩個(gè)點(diǎn)，13×11兩個(gè)陣列,左右重復(fù). GenePix Pro4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和歸一化分析，制作散點(diǎn)圖(圖2). 發(fā)現(xiàn)18個(gè)基因有明顯的改變，8個(gè)基因上調(diào)，10個(gè)基因下調(diào)（表2）.表2在A549和NCIH446細(xì)胞中差異表達(dá)基因的平均比率（略）2.3.1基因芯片的敏感性、特異性和重復(fù)性從雜交的芯片結(jié)果分析， 定量陽性對照6個(gè)點(diǎn)(圖1紅色方框)和看家基

16、因22個(gè)點(diǎn)（圖1藍(lán)色方框）均出現(xiàn)較強(qiáng)的信號，兩種陰性對照4個(gè)點(diǎn)（圖1綠色方框）均無信號.說明芯片的檢測結(jié)果敏感性和特異性是比較好的.芯片的陣列為左右對稱，從芯片左右兩個(gè)矩陣隨機(jī)選取部分探針對應(yīng)點(diǎn)，比較其檢測信號強(qiáng)度差異.結(jié)果變異系數(shù)均小于15，說明芯片的重復(fù)性較好.2.3.2RTPCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果的可信性提取A549和NCIH446細(xì)胞的總RNA，對4個(gè)基因（3個(gè)差異基因Bcl2， Cyclin B1，PKC和1個(gè)無明顯差異的基因p53）進(jìn)行RTPCR分析，結(jié)果見圖3.其余基因的變化結(jié)果和芯片結(jié)果具有較好的一致性，盡管兩種方法檢測的RNA水平數(shù)值可能是不同的.3討論為了辨別與腫瘤輻射抗性相關(guān)的一些基因，需要建立一種篩選這些基因的方法.基因芯片為高通量檢測基因表達(dá)提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，目前已被應(yīng)用到電離輻射領(lǐng)域.但是，目前放射領(lǐng)域里還沒有一款適用于放射研究的基因芯片.針對輻射誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)，我們構(gòu)建了輻射相關(guān)的寡核苷酸基因芯片，這種小型芯片去掉了眾多的干擾因素，有利于生物信息學(xué)分析，降低了成本，有利于廣泛的應(yīng)用.電離輻射除了誘導(dǎo)核內(nèi)DNA損傷，也可誘導(dǎo)一些分子表達(dá)，激活信號傳導(dǎo)途徑.我們在回顧文獻(xiàn)、分析輻射誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)輻射調(diào)節(jié)基因和可能調(diào)節(jié)的基因，通過科