嗎啡對(duì)大鼠離體工作心臟延遲性保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、嗎啡對(duì)大鼠離體工作心臟延遲性保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究              作者：王建堂 ，馬增山，馬勝軍，杜心靈   【摘要】  目的 研究嗎啡預(yù)處理對(duì)大鼠離體工作心臟缺血再灌注的延遲性保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。 方法 48只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，即對(duì)照組、嗎啡組、納絡(luò)酮組、格列本脲組、嗎啡+納絡(luò)酮組和嗎啡+格列本脲組。腹腔注射給藥24 h后，建立離體工作心臟模型，4 St.Thomas停搏液誘導(dǎo)心臟停搏30 min，復(fù)灌45mi

2、n。觀察心臟缺血再灌注前后血流動(dòng)力學(xué)恢復(fù)率、心肌酶及心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果 嗎啡組的心排出量（CO）恢復(fù)率、左室發(fā)展壓（LVDP）恢復(fù)率、左室壓力微分（±dp/dtmax）恢復(fù)率及乳酸脫氫酶（LDH）漏出量均優(yōu)于對(duì)照組（P0.05）；30 min缺血再灌注后心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕；納絡(luò)酮和格列本脲可以完全阻斷嗎啡的作用，而單獨(dú)使用納絡(luò)酮或格列本脲對(duì)大鼠心臟不產(chǎn)生影響。 結(jié)論 嗎啡預(yù)處理對(duì)缺血心肌可以產(chǎn)生延遲性保護(hù)作用，其作用與阿片受體和心肌細(xì)胞ATP敏感性鉀通道（KATP通道）介導(dǎo)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  嗎啡；延遲性心肌保護(hù)；鉀通道；阿片受體Experiment Stud

3、y of Morphine Mediate Effect of Delayed Phase of Myocardial Protection in Isolated Working Rat Heart)Abstract: OBJECTIVE   To investigate morphine mediate effect of delayed cardioprotection in rat heart. METHODS  48 male wistar rats were randomly divided into 6 groups with 8 animals i

4、n each group. There are 0.9% sodium chloride,morphine,naloxone，glibenclamide，morphine+naloxone and morphine+glibenclamide，according to different groups were administered via intraperitoneal injection. 24 hours late, the heart arrested 30 minutes with 4 St.Thomascardioplegic solution infusion followi

5、ng 45 minutes normothermic reperfusion in the isolated working rat heart.The recovery of hemodynamic effects, release of myocardial enzymes and ultrastructure of myocardium were assessed before and after ischemia. RESULTS  Morphine pretreatment significantly improved the recovery percentage of

6、postischemic CO,LVDP and +dp/dt (P0.05).Meanwhile,a lower release of LDH and ultrastructural integrity of myocardium were observed in morphine group after reperfusion.The cardioprotection effects of morphine could be abolished by naloxone or glibenclamide. CONCLUSION  Morphine pretreatment can

7、induce a delayed phase of cardioprotection via opioid receptors and KATP channels.Key words：  Morphine; Delayed myocardial protection; Potassium channel; Opioid receptor短暫的心肌缺血可使心臟對(duì)隨后更嚴(yán)重的缺血損傷產(chǎn)生較強(qiáng)的耐受能力，被稱為心臟的缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning, IPC）。IPC包括兩個(gè)階段：早期相為IPC后13 h；延遲相，又稱為延遲性預(yù)處理，出現(xiàn)在IPC后2472 h1

8、。其發(fā)生機(jī)制目前研究尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠離體工作心臟模型觀察嗎啡對(duì)心肌的延遲性保護(hù)作用，并探討阿片受體及心肌細(xì)胞鉀通道在此過(guò)程中的作用。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  健康雄性Wistar 大鼠，體重（260±20）g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2  實(shí)驗(yàn)方法  所有大鼠均于注射給藥24 h后，采用20 %烏拉坦5 ml/ kg腹腔注射麻醉，開(kāi)胸前5min腹腔注射肝素500 U/ kg，快速開(kāi)胸取出心臟浸于4 Krebs-Henseleit（K-H液）緩沖液之中，迅速主動(dòng)脈插管將心臟固定于離體心灌注裝置，

9、用37含95% O2和5% CO2的K-H液逆行灌注。結(jié)扎雙側(cè)肺靜脈，于左心耳開(kāi)口并插入內(nèi)徑3 mm的喇叭卷口導(dǎo)管，并連接恒壓貯液瓶，調(diào)整其高度控制左房負(fù)荷為10 mmHg(1.5 kPa)，通過(guò)心尖插入內(nèi)徑1 mm鉤型管進(jìn)入左心腔，并將左室插管連接壓力換能器。心尖、右心耳和主動(dòng)脈根部置心外膜電極。離體心臟行Langendorff灌注15 min后轉(zhuǎn)為左心工作狀態(tài)，主動(dòng)脈負(fù)荷50 mmHg(7.5 kPa)。10min后阻斷左房及主動(dòng)脈并于主動(dòng)脈根部灌注4 St.Thomas停搏液20 ml/ kg，停搏期間維持心肌溫度為15，30 min后開(kāi)放主動(dòng)脈鉗并行Langendorff灌注15 mi

10、n，然后恢復(fù)左心工作狀態(tài)30 min。開(kāi)放時(shí)出現(xiàn)室顫者于主動(dòng)脈根部推注利多卡因1mg并加心臟按壓至恢復(fù)竇性心律。1.3  實(shí)驗(yàn)分組  48只大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只： 對(duì)照組：腹腔注射0.9 %生理鹽水； 嗎啡組：腹腔注射嗎啡（沈陽(yáng)第一制藥廠制造）0.3 mg/ kg； 納絡(luò)酮組：腹腔注射納絡(luò)酮（湖南益僑制藥有限公司）3 mg/ kg； 格列本脲組：腹腔注射格列本脲（Sigma公司）0.3 mg/ kg； 嗎啡+納絡(luò)酮組：注射嗎啡0.3 mg/ kg前10 min注射納絡(luò)酮3 mg/ kg； 嗎啡+格列本脲組：注射嗎啡0.3 mg/ kg前30 min注射格列本脲0.3

11、mg/ kg。1.4  觀測(cè)指標(biāo)  1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較應(yīng)用方差分析，P0.05為差異有顯著意義。2  結(jié)果2.1  血流動(dòng)力學(xué)改變  缺血前各組間比較差異無(wú)顯著性意義（P0.05）。復(fù)灌后左心工作10 min和30 min時(shí)嗎啡組CO、LVDP、±dp/dt的恢復(fù)率優(yōu)于對(duì)照組，余各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異均無(wú)顯著性（P0.05）。見(jiàn)表1。2.2  心肌酶變化  缺血前LDH、

12、CK-MB值各組間差異無(wú)顯著性（P0.05）。嗎啡組在復(fù)灌后左心工作10 min、30 min時(shí)的LDH值低于對(duì)照組（P0.05），CK-MB各組在各時(shí)點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。2.3  心肌超微結(jié)構(gòu)改變  對(duì)照組、納絡(luò)酮組、格列本脲組、嗎啡+納絡(luò)酮組和嗎啡+格列本脲組心肌細(xì)胞肌絲排列紊亂、局部肌絲溶解、斷裂；線粒體腫脹，嵴排列紊亂、稀疏斷裂，可見(jiàn)空泡變性，部分線粒體膜破壞；細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，核周有積液；糖原顆粒消失。嗎啡組心肌肌絲排列基本整齊，局部肌絲排列紊亂、肌纖維收縮，肌漿網(wǎng)呈空泡狀；線粒體輕度腫脹，部分嵴排列紊亂、少量斷裂；細(xì)胞核基本正常，核仁明顯，染色質(zhì)基本

13、正常；有少量糖原顆粒。         表1   缺血后血流動(dòng)力學(xué)恢復(fù)情況（略）注：與對(duì)照組比較*P0.05;*P0.01表2  缺血前后心肌酶值改變情況（略）注：與對(duì)照組比較 *P0.053  討論   本研究應(yīng)用大鼠離體工作心臟模型，采取與臨床心臟外科手術(shù)相似的處理過(guò)程，觀察到：?jiǎn)岱让黠@改善了大鼠的心臟功能，LDH釋放減少，心肌超微結(jié)構(gòu)損傷輕，發(fā)揮了延遲性心肌保護(hù)作用。嗎啡預(yù)處理前給予阿片受體阻滯劑納絡(luò)酮和KATP通道阻滯劑格列本脲可使嗎啡的心肌保護(hù)作

14、用消失。單獨(dú)使用納絡(luò)酮或格列本脲對(duì)大鼠心臟不產(chǎn)生影響。   阿片受體在體內(nèi)分布廣泛，不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且在心臟、腎上腺髓質(zhì)、血管、消化道、腎臟等外周組織存在。阿片受體包括、型，型又分為1、2兩種亞型。嗎啡作為一種非選擇性的阿片受體激動(dòng)劑，一般認(rèn)為嗎啡對(duì)型受體有高度親和力，但嗎啡也能與、受體相互作用。研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血前24 h給予選擇性-阿片受體激動(dòng)劑，可以顯著降低大鼠心肌梗死的面積2，本研究結(jié)果表明嗎啡預(yù)處理產(chǎn)生了延遲性心肌保護(hù)作用，納絡(luò)酮能夠拮抗其心肌保護(hù)作用，表明嗎啡的心肌保護(hù)作用與激活阿片受體有關(guān)。目前認(rèn)為延遲預(yù)處理對(duì)心肌組織的保護(hù)作用與蛋白質(zhì)合成和（或）翻譯

15、后修飾有關(guān)，內(nèi)源性或外源性阿片樣物質(zhì)作用于相應(yīng)的阿片受體，激活細(xì)胞內(nèi)化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前研究比較肯定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有蛋白激酶C（PKC）、酪氨酸蛋白激酶（PTKs）、促絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）等途徑，最終導(dǎo)致核因子- B（NF- B）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（STATs）活化，多種心肌保護(hù)基因轉(zhuǎn)錄，合成心肌保護(hù)蛋白，如誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）3、超氧化物歧化酶（SOD）、醛糖還原酶、熱休克蛋白（HSPs）等，這些蛋白質(zhì)的表達(dá)在延遲預(yù)處理后1224 h出現(xiàn)，持續(xù)34天并逐漸衰減，與延遲相發(fā)生的時(shí)間相一致，而且有證據(jù)表明KATP也參與介導(dǎo)了延遲性保護(hù)作用4-

16、5。   KATP通道是心肌細(xì)胞普遍存在的離子通道。本研究發(fā)現(xiàn)格列本脲完全阻斷了嗎啡的延遲性心肌保護(hù)作用，提示阿片受體激活可以引起KATP通道活化開(kāi)放。KATP通道介導(dǎo)心肌保護(hù)作用的機(jī)制有以下幾個(gè)方面：減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，減少缺血心肌的能量消耗。Ca2+穩(wěn)態(tài)的保持在IPC的保護(hù)作用中具有重要地位，Ca2+超載是引起細(xì)胞損傷的重要原因之一6。心肌細(xì)胞膜上KATP通道開(kāi)放導(dǎo)致Ca2+通道關(guān)閉，K+外流增加，復(fù)極加快，動(dòng)作電位時(shí)程縮短，平臺(tái)期Ca2+內(nèi)流減少；較低的靜息電位易于通過(guò)Na+/Ca2+交換排出細(xì)胞內(nèi)Ca2+，從而使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平降低，缺血心肌收縮力減弱，A

17、TP消耗減少。減少氧自由基的形成。KATP通道開(kāi)放使缺血心肌的過(guò)氧化物釋放減少7，從而減低氧自由基對(duì)心肌收縮力以及冠狀動(dòng)脈血流量的抑制作用，減輕再灌注時(shí)氧自由基對(duì)心肌的有害作用。 抑制心肌細(xì)胞凋亡。PKC激活劑與P38 MAPK激動(dòng)劑產(chǎn)生的效應(yīng)可被KATP通道阻斷劑所阻斷8，而MAPK的激活被認(rèn)為是IPC抑制心肌細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制。   心肌細(xì)胞上存在兩種KATP通道，分別位于心肌纖維膜（sarcKATP通道）和線粒體膜（mitoKATP通道）上。在IPC介導(dǎo)的延遲性心肌保護(hù)作用中sarcKATP通道僅發(fā)揮觸發(fā)劑作用9，在阿片受體介導(dǎo)的延遲性心肌保護(hù)作用中，mitoKATP

18、通道發(fā)揮終末效應(yīng)器作用10-11。這兩種KATP通道在參與心肌保護(hù)過(guò)程作用相互補(bǔ)充，但兩者的具體作用和機(jī)制尚存在爭(zhēng)議12，有待進(jìn)一步探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Gross GJ. Role of opioids in acute and delayed preconditioningJ. J Mol Cell Cardiol, 2003, 35(7): 709-718.2 Patel HH, Fryer RM, Gross ER, et al. 12-lipoxyenase in opioid induced delayed cardioprotection: gene array,

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