土霉素對酶催化產(chǎn)物的熒光猝滅機(jī)理研究及其測定

1、第28卷第3期分析測試學(xué)報Vol128No132009年3月FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)353356土霉素對酶催化產(chǎn)物的熒光猝滅機(jī)理研究及其測定張苗,岳寧寧,呂慶鑾,宮斌,王懷友(山東師范大學(xué)化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院,山東濟(jì)南250014)摘要:酪氨酸在辣根過氧化物酶催化下被H2O2氧化為強(qiáng)熒光物質(zhì)S,土霉素對其熒光產(chǎn)生猝滅作用,根據(jù)Stern-Volmer方程和熒光壽命研究發(fā)現(xiàn)土霉素對產(chǎn)物S的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅。實(shí)驗(yàn)得到土霉素與強(qiáng)熒6光物質(zhì)S反應(yīng)的形成常數(shù)K=1193×10L/mol(25),結(jié)合點(diǎn)數(shù)n=1195。反應(yīng)

2、熱力學(xué)參數(shù)G<0,H>0,說明該反應(yīng)是自發(fā)的吸熱過程。根據(jù)熒光猝滅原則建立了測定土霉素的新方法,土霉素質(zhì)量濃度在51608010mg/L范圍內(nèi)與IF/IF呈線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為019968,檢出限為0190mg/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差0為0173%。關(guān)鍵詞:辣根過氧化物酶;熒光猝滅;土霉素;熱力學(xué)參數(shù)中圖分類號:O65713;R978114文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1004-4957(2009)03-DeterminationofOxytetracyclineBasedtheofEnzyme2catalyzedZHANGMiao,YUENing2ning,2in,WANGHuai2yo

3、u(CollegeofChemistry,ChemicalMNormalUniversity,Jinan250014,China)Abstract:oxytetracycline(OTC)couldquenchthefluorescenceoftyrandH2O2undertheenzyme2catalyticreactionofhorseradishper2onamethodforthedeterminationofOTCwasdeveloped.AccordingtotheStern-merplotandthefluorescencelifetime,thefluorescencequen

4、chingwasconfirmedtobeastaticone.Resultsshowedthatthebindingconstant(K)andthenumberofbindingsites(n)obtainedfromthereactionofOTCwithsubstanceSwere1193×10L/mol(25)and1195,respectively.Thereactionthermodynamicparameters(G<0,H>0)indicatedthatthereactionwasaspontane2ousendothermicprocess.Thequ

5、enchedfluorescenceintensityofsubstanceSwasproportionaltotheconcentrationofOTCovertherangeof5160-8010mg/Lwithacorrelationcoefficientof019968.Thedetectionlimitandtherelativestandarddeviationwere0190mg/Land0173%,respectively.Keywords:horseradishperoxidase;fluorescencequenching;oxytetracycline;thermodyn

6、amicpa2rameters6土霉素為四環(huán)類抗生素,屬廣譜抗菌藥,可作為預(yù)防和治療畜禽疾病的獸藥或作為促進(jìn)畜禽生長1的飼料添加劑而廣泛應(yīng)用于可食性動物中。因其良好的殺菌、抑菌作用被用于防治動物和水產(chǎn)品的2疾病感染,但在發(fā)揮藥效的同時對動物體有較大的毒副作用。因此,研究土霉素與生物分子的結(jié)合機(jī)理及土霉素含量的檢測,對確保用藥安全具有重要的實(shí)際意義。目前,土霉素的研究和測定方法主要有高效液相色譜法、紫外可見分光光度法、電化學(xué)方法等。熒光分析法因其靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于化學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。關(guān)于土霉素的熒光測定方法報道較少,本文采用熒光光度法對土霉素進(jìn)行了測定。8辣根過氧化物酶(H

7、RP)是從植物中提取的一種重要的酶制劑,被廣泛應(yīng)用于生物工藝技術(shù)、生物傳感器9-103-567、有機(jī)合成11等領(lǐng)域。已有報道酪氨酸在辣根過氧化物酶催化下被H2O2氧化為強(qiáng)熒光12物質(zhì)(產(chǎn)物S),反應(yīng)方程式如圖1所示。實(shí)驗(yàn)研究了土霉素對產(chǎn)物S的熒光猝滅機(jī)理,并根據(jù)熒光猝滅原則建立了測定土霉素的新方法。收稿日期:基金項(xiàng)目:第一作者:通訊作者:2008-09-18;修回日期:2008-10-26山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y2006B31)張苗(1980-),女,山東濰坊人,碩士研究生王懷友,TelE-mail:wanghuaiyousdnu1edu1cn354分析測試

8、學(xué)報第28卷1實(shí)驗(yàn)部分111儀器與試劑FLS2920熒光分光光度計(Edinburgh,英國)可用于熒光壽命的測定;LS250熒光分光光度計(Perkin-El2mer,美國);pHS23C型酸度計(上海雷磁儀器廠);Di2rect2Q3(Millipore,美國)超純水系統(tǒng);YXCS型超級數(shù)顯恒溫器(山東鄄城永興儀器廠)。土霉素(化學(xué)對照品,純度9214%,中國藥品生物制品檢定所);L2酪氨酸(生化試劑,上海試劑廠);辣根過氧化物酶(HRP,酶活性為250330U/mg,酶的純度為310);土霉素片(山東金洋藥業(yè)有限公司);其他所用試劑均為分析純。土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(800mg/L);HRP溶

9、液(100mg/L);L2酪氨酸溶液(400mg/L逐級稀釋至所需濃度,均于4下避光保存。H2O2溶液(01。pH815的Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl緩沖溶液。圖1反應(yīng)方程式Fig11Thereactionequation土霉素片樣品溶液的制備:取本品6片,研細(xì),10100mL水,超聲處理50min,離心,取上層清液轉(zhuǎn)移到100mL,作為待測試樣。112實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確移取018050mLH2O2、210mLpH815的Tris-HCl緩沖溶液于10mL搖勻,作為溶液A。另取同量的上述試劑于另一比色管中,35min后加入110,用水稀釋至刻度并搖勻,作為溶液B。2211熒光猝滅光譜按照“1

10、12”步驟,繪制產(chǎn)物S加入土霉素前后的發(fā)射光譜,結(jié)果見圖2。產(chǎn)物S的最大發(fā)射波長為400nm。土霉素存在下,產(chǎn)物S的熒光強(qiáng)度明顯降低,表明發(fā)生了熒光猝滅。212熒光猝滅機(jī)理探討熒光猝滅分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅及動態(tài)靜態(tài)相結(jié)合的猝滅,猝滅關(guān)系可用Stern-Volmer方程描述。如果靜態(tài)猝滅與動態(tài)猝滅同時存在,S-V曲線具有向上彎曲的非直線特征,并滿1002足下列多項(xiàng)式:IF/IF=1+(KD+KS)cQ+KDKScQ,KD、KS分別為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅常數(shù),IF、IF分別為未加入猝滅劑和加入猝滅劑時的熒光強(qiáng)度,cQ為猝滅劑的濃度。本實(shí)驗(yàn)的線00性方程為IF/IF=017794+010244c,相

11、關(guān)系數(shù)為019968,S-V圖為線性,所以土霉素對產(chǎn)物S的熒光猝滅不是動態(tài)猝滅與concentrationofoxytetracycline:3010mg/L靜態(tài)猝滅結(jié)合的猝滅。0如果猝滅過程為動態(tài)猝滅,則滿足Stern-Volmer方程:IF/IF=1+kq0cQ=1+KsvcQ,kq為猝滅過-1-1程的速率常數(shù)(單位Lmols),0為沒有猝滅劑存在時熒光分子的熒光壽命,Ksv為Stern-1Volmer猝滅常數(shù)(單位Lmol),S-V方程呈線性。圖2加入土霉素前(a)、后(b)產(chǎn)物S的發(fā)射光譜Fig12EmissionspectraofsubstanceSbefore(a)andafter

12、(b)addingoxytetracycline如果猝滅過程為靜態(tài)猝滅,熒光強(qiáng)度降低是由于形成了非熒光化合物,則滿足S-V方程:I/IF=1+KcQ,K為形成常數(shù),S-V方程也呈線性。通過熒光壽命的測定可區(qū)分動態(tài)與靜態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅時,猝滅劑的存在不改變熒光分子的壽命;0而在動態(tài)猝滅情況下,猝滅劑的存在使熒光分子壽命縮短。即0/1=1時為靜態(tài)猝滅,0/1=IF/IF0F時為動態(tài)猝滅。本實(shí)驗(yàn)中土霉素作為熒光猝滅劑,產(chǎn)物S的熒光壽命在加入土霉素前后無明顯變化(圖3和圖4),表明產(chǎn)物S和土霉素之間發(fā)生靜態(tài)猝滅。0=5136ns,1=5137ns,即0/11。14第3期張苗等:土霉素對酶催化產(chǎn)物的熒光

13、猝滅機(jī)理研究及其測定355213靜態(tài)猝滅形成常數(shù)與結(jié)合點(diǎn)數(shù)對靜態(tài)猝滅反應(yīng)來說,那么熒光分子和猝滅劑之間可按下式反應(yīng)12:nQ+BQn-B,Qn-B是猝滅的熒光分子,n在本文中熒光分子即產(chǎn)物S,Ka=c(Qn-B)/(cQcB)。00()是cB,則cB=c(Qn-B)+cB,cB是未反應(yīng)的cBcB=IF/IF,IF和IF分別為熒光分子在猝滅分子存在和不存在時的熒光強(qiáng)度,那么IFIF)/IF=lgK+nlgcQ,K是猝滅分子與熒光分子的形成常數(shù),n為結(jié)合點(diǎn)數(shù)。用0lg(IF-IF)/IF對lgcQ作圖,直線斜率為n,截距為lgK,即得土霉素與產(chǎn)物S的形成常數(shù)K=1193×00010L/m

14、ol(25),結(jié)合點(diǎn)數(shù)n=1195,曲線的相關(guān)系數(shù)r=019914,為顯著性相關(guān)。6214反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)根據(jù)vantHoff方程lnK=-H(RT)+SR,得到土霉素與產(chǎn)物S反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)。其中H-1S求與S由lnK對T作圖所得曲線的斜率(-HR)和截距(SR)求出,G由方程G=H-T得,見表1。G<0,H>0,說明反應(yīng)是自發(fā)的吸熱過程。升高溫度有利于反應(yīng)向產(chǎn)物的方向進(jìn)行,這與表中形成常數(shù)顯示的大小變化規(guī)律相符。T/K表1反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)Table1ReactionthermodynamicparametersK2913013113213331139214841646198215實(shí)

15、驗(yàn)條件的優(yōu)化21511pH值的影響試驗(yàn)了pH(1101210)對體系熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果表(-1)(-1)(-1mol-1)-341244217126413×1066-36187×106-39171×106-42108×107-45136明,pH為810819時體系熒光強(qiáng)度穩(wěn)定,故選擇pH815的Tris-HCl緩沖溶液控制體系的pH值。21512H2O2用量與HRP加入量的影響按照“112”分析步驟,當(dāng)H2O2加入量為0150mL時體系熒光強(qiáng)度最大,故加入0150mL01003(體積分?jǐn)?shù))的H2O2。當(dāng)加入HRP(50mg/L)的體積大于0180mL時

16、,體系熒光強(qiáng)度最大且保持不變,所以實(shí)驗(yàn)時選擇加入0180mL50mg/L的HRP。21513試劑加入順序及反應(yīng)時間的影響試驗(yàn)了試劑加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)表明,最佳加入順序?yàn)镠RP、酪氨酸、H2O2、緩沖溶液、土霉素。測定了不同反應(yīng)時間對體系熒光強(qiáng)度的影響。室溫下反應(yīng)30min后,體系熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定,因此選擇反應(yīng)時間為35min。加入土霉素后熒光強(qiáng)度降低,5min后熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定且保持不變,故加入土霉素6min后再進(jìn)行測定。21514干擾離子的影響分析了常見離子對測定3010mg/L土霉素溶液的影響。相對誤差控制在356分析測試學(xué)報第28卷±5%內(nèi)。干擾離子以500mg

17、/L為起始質(zhì)量濃度,如果存在干擾,降低干擾離子的質(zhì)量濃度直至干擾+-+-2-3-消除。結(jié)果如下:K、H2PO4、Cl允許存在量500mg/L;Na、Ac、HPO4、PO4允許存在量400mg/L;NO3、SO4、Mg允許存在量250mg/L;CO3、HCO3與Ca允許存在量分別為200、150、1mg/L。-2-2+2-2+216工作曲線、精密度與檢出限土霉素質(zhì)量濃度在51608010mg/L范圍內(nèi)與IF/IF呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為c=40198IF/IF-31194,IF為產(chǎn)物S的熒光強(qiáng)度,IF為土霉素存在時產(chǎn)物S的熒光強(qiáng)度,c為土霉素的濃度,線性相關(guān)系數(shù)為019968。同一樣品測

18、定11次,測得土霉素的平均質(zhì)量濃度為30114mg/L,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0173%。同法測定空白11次,測得檢出限為0190mg/L。217樣品分析與回收率實(shí)驗(yàn)分別取0150、110、310mL待測試樣,測定土霉素的質(zhì)量濃度,13果對照。測定3次取平均值,在置信度等于95%時,用Cochran檢驗(yàn),2異。樣品分析與回收率結(jié)果見表2。表2Table2No123ProposedmethodUVspectrophot-1±01120170116/(mgL-1)7151±010815130456Found-1Recovery-1101015102010/(mgL61006100610

19、0)L/(mg161219172516)RSDs/%0162013421621037893參考文獻(xiàn):1馬玉紅,史海燕.土霉素研究概況J.青海畜牧獸醫(yī)雜志,2007,37(4):45-46.2張美金,林峰,林海丹,等.飼料中四環(huán)素類藥物含量的高效液相色譜測定J.分析測試學(xué)報,2007,26(6):918-920.3PATRICIAPM,SUANNER,FELIXGRR.DeterminationofoxytetracyclineintomatoesbyHPLCusingfluorescencedetectionJ.FoodChem,2008,17(1):212-218.4WANGLinling,

20、YANGHai,ZHANGChunwei,etal.Determinationofoxytetracycline,tetracyclineandchlorampheni2colantibioticsinanimalfeedsusingsubcriticalwaterextractionandhighperformanceliquidchromatographyJ.AnalChimActa,2008,619(1):54-58.5龐國芳,曹彥忠,張進(jìn)杰,等.高效液相色譜法同時測定禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留的研究J.分析測試學(xué)報,2005,24(4):61-63.6邱光成,高宏艷.紫

21、外分光光度法測定土霉素片中間體(顆粒)的含量J.黑龍江醫(yī)藥,2007,20(5):434-435.7張敏,程發(fā)良,姚海軍.土霉素的電化學(xué)性質(zhì)及其與DNA相互作用的研究J.分析測試學(xué)報,2007,26(5):634-637.8RYANBJ,CAROLAN,OFAGAINC.Horseradishandsoybeanperoxidases:comparabletoolsforalternativenichesJ.TrendsBiotechnol,2006,24(8):355-363.9XUShiyi,PENGBo,HANXiaozu.Athird2generationH2O2biosensorbasedonhorseradishperoxidase2labeledAunan