TGF-β1 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1、TGF-1 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究摘摘 要：要：目的: 應(yīng)用比較蛋白組學(xué)方法研究 TGF-1 誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）過程中相關(guān)靶蛋白的表達(dá)變化。方法: 用雙向凝膠電泳（2-DE）對 TGF-1 刺激組和對照組 NRK52E 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行分離，兩組間差異蛋白點(diǎn)用質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定，并在蛋白質(zhì)和 mRNA 水平上進(jìn)一步檢測驗(yàn)證。結(jié)果:鑒定出 22 個(gè)差異蛋白，包括與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，參與物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝的酶類，與蛋白翻譯后修飾相關(guān)蛋白，細(xì)胞因子及其它蛋白等。應(yīng)用 RT-PCR檢測了 transgelin，ATP 合成酶 亞型，蘋果酸脫氫酶，絲氨酸（半胱胺酸）蛋白

2、酶抑制因子，Ubiquitin-Conjugating Enzyme Ubc9 和表皮生長因子8 在兩組間 mRNA 水平存在差異，與 2-DE 結(jié)果一致，用 Western blot 驗(yàn)證了transgelin，ATP 合成酶 亞型兩種蛋白的表達(dá)差異，與 2-DE 結(jié)果一致。結(jié)論: TGF-1 刺激 EMT 發(fā)生過程中可誘導(dǎo)包括與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，與翻譯后修飾相關(guān)蛋白，代謝酶類及細(xì)胞因子等多種蛋白表達(dá)變化，有助于深入理解EMT 的具體分子機(jī)制，闡明腎臟疾病慢性進(jìn)展的機(jī)制。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)；TGF-1；上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化腎小管間質(zhì)纖維化在慢性腎臟疾病進(jìn)展中起重要作用，其主要病理特征是腎間

3、質(zhì)肌成纖維細(xì)胞的增殖活化和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。已有的研究表明，肌成纖維細(xì)胞主要來源于腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（Epithelial to mesenchymaltransition ，EMT）1，2，3，選擇性地阻斷腎小管上皮細(xì)胞的 EMT 可以明顯減輕腎臟纖維化程度4。在致腎臟纖維化的多種細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF-）被認(rèn)為是最重要的致纖維化因子。已有的研究證實(shí)，TGF-1 致纖維化的主要細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象是誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。本研究的主要目的就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究在 TGF-1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化細(xì)胞模型中究竟導(dǎo)致了哪些蛋白質(zhì)譜的表達(dá)變化以

4、及這些蛋白在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中的作用和意義。1.1. 材料與方法材料與方法1.1 主要儀器與試劑NRK52E 細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科鄭法雷教授惠贈(zèng))，胎牛血清和 DMEM-F12 培養(yǎng)基(美國 Gibco BRL 公司)，羊抗 transgelin 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司），小鼠抗 ATPSynthase 單克隆抗體（美國 BDTransduction laboratories 公司），羊抗小鼠 IgG，兔抗羊 IgG（美國 SantaCruz 公司）TaqDNA 聚合酶(美國 MBI 公司) , Trizol Reagent(美國InvitrogenLife T

5、echnologies 公司) ，DTT、丙烯酰胺、N，N甲叉雙丙烯酰胺、尿素、CHAPS、TEMED、胰蛋白酶（美國 Sigma 公司公司），pH310 24cmIPG 預(yù)制干膠條、IPG pH 310 緩沖液，IPGphor 等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALTsix 電泳系統(tǒng) 、Image Master 2D platinum 5.0 圖像分析軟件、Ettan SpotHandling Workstation 工作站，MALDITOF 質(zhì)譜儀，（瑞典Amershamphamacia biotech 公司），Beckman L765 低溫高速離心機(jī)（美國Beckman 公司）。1.2 細(xì)胞處

6、理NRK52E 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%FBS 的 DMEM-F12 培養(yǎng)液中, 置于含 5%CO2 培養(yǎng)箱 37培養(yǎng)。 待細(xì)胞生長至 90%亞融合狀態(tài)時(shí)消化，等份分成實(shí)驗(yàn)組和對照組兩組各三皿，當(dāng)培養(yǎng)接近 60面積，更換無血清培養(yǎng)基使細(xì)胞生長同步化 24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入 10ng/ml TGF1，對照組為等體積無血清培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 小時(shí)。1.3 蛋白質(zhì)提取冰上每皿各加入 250ul 裂解液靜置 10 分鐘，刮下細(xì)胞，超聲破碎、20000g 離心 30min 收集上清液，經(jīng) Clean up kit 試劑盒純化細(xì)胞總蛋白，去除鹽類、脂類等雜質(zhì)。BCA 法測蛋白濃度。每個(gè)樣品取 600ug 上樣進(jìn)

7、行雙向電泳。1.4 雙向凝膠電泳（1）第一向等電聚焦電泳：主要參考 G?rg 等的方法5和 IPGphorTM 等電聚焦系統(tǒng)操作指南進(jìn)行。（2）平衡：等電聚焦結(jié)束后，迅速取出 IPG 膠條于 10ml 平衡液（50mmol/LTrisHcl pH 8.8，6mol/L 尿素，30甘油，2SDS ，1DTT 和痕量溴酚藍(lán)）中平衡 15 分鐘，再置于 10ml 平衡液（2.5碘乙酰胺取代 1DTT）中平衡 15 分鐘。（3）第二向垂直 SDSPAGE電泳：將平衡后的 IPG 膠條移至 12.5SDSPAGE 連續(xù)膠上端，1瓊脂糖封固。20循環(huán)水恒溫，先以 15mA/每塊膠進(jìn)樣，再以 30mA/每塊

8、膠恒流電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)距膠底邊 0.51cm 處停止電泳。凝膠固定后以膠體考馬斯亮藍(lán)染色。1.5 凝膠圖像分析圖像掃描儀經(jīng)調(diào)整參數(shù)后透射掃描 2DE 凝膠，存儲(chǔ)為 tif 文件。以Image Master 2Dplatinum5.0 軟件包進(jìn)行圖像分析，產(chǎn)生差異表達(dá)蛋白點(diǎn)數(shù)據(jù)信息。1.6 膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜鑒定在 Workstation 工作站內(nèi)利用機(jī)械手從膠上挖取差異蛋白點(diǎn)，脫色、脫水，酶解，加多肽提取液孵育，獲得的多肽混合液真空蒸發(fā)干燥，加基質(zhì)混勻點(diǎn)樣于 MALDI 加樣板上，進(jìn)入 MALDITOF 質(zhì)譜儀進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜鑒定，并在 NCBInr 數(shù)據(jù)庫中行蛋白查詢。1.7 半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合

9、酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白質(zhì)免疫印記（Westernblot）驗(yàn)證結(jié)果蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 transgelin，ATP 合成酶 亞型 2 種蛋白質(zhì)在刺激組與空白對照組中的表達(dá)豐度差異，化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，計(jì)算待測指標(biāo)與內(nèi)參 GAPDH 灰度的比值。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測transgelin，ATP 合成酶 亞型，表皮生長因子 8，絲氨酸（半胱胺酸）蛋白酶抑制因子，Ubc9 和蘋果酸脫氫酶 6 種蛋白 mRNA 水平的表達(dá)差異，計(jì)算待測指標(biāo)與內(nèi)參 GAPDH 吸光度 A 的比值。2.2. 結(jié)果結(jié)果2.1 雙向凝膠電泳分析我們選擇 pH 310 范圍的非線性干膠條進(jìn)行第一向等電

10、聚焦電泳。第二向電泳為 12.5SDS-PAGE。TGF1 刺激組和對照組分別重復(fù) 3 次， 共獲得6 塊 2D 膠圖譜。從所獲得的結(jié)果來看，所有的蛋白表達(dá)譜均類似，多集中分布于 pI 48 間的區(qū)域（見圖 1），以 ImageMaster 2D platinum 5.0 軟件包將凝膠分成 2 個(gè)類別進(jìn)行點(diǎn)的圖像分析。選擇其中 2DE 效果好、點(diǎn)數(shù)多的一塊膠作為參考膠，進(jìn)行兩組間的匹配分析，篩選出每組三塊膠中均存在的 2 倍及以上的差異點(diǎn)有 39 個(gè)。2.2 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定挖取所有 39 個(gè)蛋白點(diǎn)，然后用胰蛋白酶膠內(nèi)酶切，在 MALDITOF 質(zhì)譜儀上得到特征性的多肽質(zhì)量譜并最終鑒定出 2

11、2 個(gè)蛋白點(diǎn)，其中上調(diào)表達(dá) 17 種，下調(diào)表達(dá) 3 種，新生蛋白 2 種。在相同細(xì)胞培養(yǎng)及 TGF-1 刺激條件下，利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證 transgelin，ATP 合成酶 亞型，表皮生長因子 8，絲氨酸（半胱胺酸）蛋白酶抑制因子，Ubiquitin-Conjugating Enzyme Ubc9 和蘋果酸脫氫酶 mRNA水平的表達(dá)差異，結(jié)果與蛋白組學(xué)所得結(jié)果一致，TGF-1 刺激 NRK52E 細(xì)胞可明顯上調(diào)這 6 種蛋白 mRNA 表達(dá)水平（P0.05）。同時(shí)用蛋白質(zhì)免疫印記驗(yàn)證 transgelin 和 ATP 合成酶 亞型在刺激組與對照組中的表達(dá)差異，結(jié)果與蛋白組學(xué)所得結(jié)

12、果一致，這兩種蛋白在刺激組表達(dá)水平均上調(diào)（P0.05）。3.3. 討論討論腎小管間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病向終末期腎病發(fā)展的共同路徑，也是決定腎臟疾病進(jìn)展速率的主要因素。腎小管間質(zhì)纖維化的組織學(xué)特征是腎小管萎縮和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，細(xì)胞外基質(zhì)被認(rèn)為主要是由平滑肌肌動(dòng)蛋白（-SMA）陽性肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。已有的研究表明，TGF-1 是具有多種重要生物學(xué)作用的生長因子，在多種器官和組織的纖維化過程中發(fā)揮重要作用，包括腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。近年研究表明，TGF-1 誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是導(dǎo)致進(jìn)展性腎小管間質(zhì)纖維化的重要環(huán)節(jié)。因此，研究 TGF-1 誘導(dǎo) EMT 發(fā)生過程中靶蛋白的表達(dá)

13、變化有助于更全面認(rèn)識 TGF-1 的作用機(jī)制，并據(jù)此探討針對靶蛋白的特異性防治腎臟纖維化的措施。我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察 TGF-1 刺激腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT 后的蛋白表達(dá)譜，并與空白對照組比較，結(jié)果鑒定出 22 種差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)表達(dá) 17 種，下調(diào)表達(dá) 3 種，新生蛋白 2 種，多數(shù)是參與物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝的酶類，另外還包括與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，與蛋白翻譯后修飾相關(guān)蛋白，細(xì)胞因子及其它尚未有明確功能研究報(bào)道的蛋白。本研究檢測出一組細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白均上調(diào)表達(dá)：transgelin、膜聯(lián)蛋白A8、ERM 結(jié)合磷蛋白、destrin、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白 2/3 復(fù)合體以及微管相關(guān)蛋白。

14、transgelin 最先發(fā)現(xiàn)于平滑肌細(xì)胞，由 Tagln 基因編碼，是一種對細(xì)胞轉(zhuǎn)化和形態(tài)變化敏感的肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白。最近研究顯示，transgelin 表達(dá)下調(diào)可通過減少肌動(dòng)蛋白數(shù)量，影響肌絲結(jié)構(gòu)而使小鼠血管平滑肌伸縮力下降8。transgelin 在 TGF-1 刺激組中表達(dá)上調(diào)，可能與上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中肌絲重組導(dǎo)致細(xì)胞伸縮力的增強(qiáng)相關(guān)，可引起細(xì)胞遷移力，侵襲力增強(qiáng)。肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白 2/3 復(fù)合體由 7 個(gè)亞單位組成，在細(xì)胞內(nèi)受到多種核化促進(jìn)因子的調(diào)節(jié)，并與這些因子協(xié)同作用來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的核化，介導(dǎo)了新微絲的產(chǎn)生，并將這些新微絲連接成為高度有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)9。在 TGF-1 刺激組肌動(dòng)

15、蛋白相關(guān)蛋白 2/3 復(fù)合體上調(diào)表達(dá)可能加速肌動(dòng)蛋白裝配成微絲，對細(xì)胞骨架和細(xì)胞形態(tài)的改變發(fā)揮重要作用。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中蛋白纖維網(wǎng)狀骨架體系，其功能不僅在于維持細(xì)胞形態(tài)，保持細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的有序性，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，而且是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的傳導(dǎo)裝置，影響細(xì)胞基因表達(dá)的整體調(diào)控。NRK52E 細(xì)胞在轉(zhuǎn)分化過程中，細(xì)胞極性消失，細(xì)胞形態(tài)由卵圓鋪路石樣變?yōu)榧?xì)長纖維狀，這與細(xì)胞骨架的變化是密不可分的，因此這些細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的上調(diào)表達(dá)可能促使細(xì)胞骨架蛋白如微管、微絲等的重組，在細(xì)胞內(nèi)形成張力絲，使細(xì)胞黏附力下降等。腎小管 EMT 的發(fā)生主要涉及上皮細(xì)胞黏附特性喪失，腎小管基底膜的破壞以及細(xì)胞遷移力，侵襲力

16、的增強(qiáng)，這些都與細(xì)胞骨架的改變相關(guān)。本研究鑒定出兩種與蛋白翻譯后修飾相關(guān)的蛋白，Ubc9 和泛醇 1。Ubc9是蛋白 SUMO 化過程中唯一的 SUMO 結(jié)合酶，SUMO(small ubiquitin-relatedmodifier)是泛素(ubiquitin)類蛋白家族的重要成員之一，SUMO 化（sumoylation）與泛素化（ubiquitination）不同，它并不促使蛋白質(zhì)降解，反而是加強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或是調(diào)節(jié)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布，調(diào)節(jié)蛋白之間的相互作用以及影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性10，11。新近的研究顯示 SUMO 化可能參與調(diào)節(jié) Smad 家族蛋白的功能。同時(shí)共表達(dá) Ubc9

17、 或 SUMO-1 能顯著增強(qiáng)Smad4 的 SUMO 化，還可促進(jìn) Smad1，-2，-3 與 SUMO-1 的結(jié)合，但明顯弱于Smad4 的 SUMO 化水平12，13。TGF-1 刺激能增強(qiáng) Smad4 的 SUMO 化，抑制 Ubc9 的表達(dá)可抑制 Smad4 SUMO 化水平的增高，還顯著降低 TGF-1 所介導(dǎo)的 PAI-1 的產(chǎn)生14。我們發(fā)現(xiàn) TGF-1 刺激能導(dǎo)致 Ubc9 上調(diào)表達(dá)，這可能是 TGF-1 刺激下 Smad4 的 SUMO 化水平增高的重要環(huán)節(jié)。Smad 家族蛋白是介導(dǎo) TGF-1 作用的重要信號通路，TGF-1 刺激上調(diào)表達(dá) Ubc9，促進(jìn)SUMO 化反應(yīng)，

18、進(jìn)而保持其下游關(guān)鍵信號蛋白 Smad 的穩(wěn)定性，從而幫助實(shí)現(xiàn)TGF-1 的生物學(xué)效應(yīng)。在 TGF-1 誘導(dǎo)腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞模型與對照組細(xì)胞蛋白質(zhì)組的比較分析中，我們獲得了許多差異蛋白質(zhì)信息，也遇到一些值得探討的新問題，這些蛋白質(zhì)信息將為我們?nèi)嫠褜づc TGF-1 促使細(xì)胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的蛋白提供有價(jià)值的參考資料，而面臨的新問題將促使我們從新的角度探討 TGF-1 誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的具體機(jī)制。十年論文機(jī)構(gòu)京都名師論文中心，正規(guī)全面的論文刊物為您提供職稱論文，畢業(yè)論文，碩士論文，醫(yī)學(xué)論文，教育論文等各類論文發(fā)表服務(wù)。參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1. Yang J,Liu Y: Dissection of ke

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