研究室細胞及分子實驗操作指南1

1、研究室細胞與分子實驗操作指南研究室細胞與分子實驗操作指南2目目 錄錄第一章第一章 細胞實驗操作細胞實驗操作3第一節(jié) 細胞培養(yǎng)常用耗材與設(shè)備3第二節(jié) 無菌操作3第三節(jié) 培養(yǎng)用品的清洗5第四節(jié) 培養(yǎng)用品的消毒滅菌及滅菌鍋的使用6第五節(jié) 常用緩沖液、胰蛋白酶消化液及培養(yǎng)基的配制8第六節(jié) 細胞培養(yǎng)、換液、消化傳代11第七節(jié) 細胞計數(shù)13第八節(jié) 細胞復(fù)蘇與凍存15第九節(jié) MTT 法測定細胞活力或細胞增殖16第二章第二章 分子實驗操作分子實驗操作17第一節(jié) PCR 引物設(shè)計與實驗操作17第二節(jié) WESTERN BLOT 實驗操作25第三節(jié) FLOW CYTOMETRY實驗操作313第一章第一章 細胞實驗操

2、作細胞實驗操作第第 1 節(jié)節(jié)細胞培養(yǎng)常用耗材與設(shè)備細胞培養(yǎng)常用耗材與設(shè)備1. 準備室中常見耗材與設(shè)備準備室中常見耗材與設(shè)備 去離子水制備器、酸缸、烘箱、高壓滅菌鍋、儲備柜（放置干凈未消毒的物品） 。 容量瓶（500 ml，1L） 、錐形瓶（500 ml，1L） 、磁力攪拌器、pH 計、電子精密天平、臺式離心機、冷凍離心機、渦旋器、普通冰箱（4，-20） 、超低溫冰箱（-70） 。 細胞培養(yǎng)瓶（25mm2，75mm2 ，175mm2） 、細胞培養(yǎng)板（96-well，24-well，12-well，6-well） 、細胞培養(yǎng)皿（35mm，60mm） 、細胞凍存管（2ml，5ml） 、離心管（10m

3、l） 、移液管（2ml，5ml，10ml） 。 移液槍（2.5l，10l，100l，200l，1000l，5ml） ，槍頭（10l，200l，1ml；顏色分別為：白，黃，藍） ，eppendorf 管（0.5ml、1.5ml） 。2. 細胞房中常見耗材與設(shè)備細胞房中常見耗材與設(shè)備 超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、倒置顯微鏡、普通冰箱（4，-20） 。 酒精噴壺（裝 75%酒精） ，酒精棉（濃度為 75%） 、純酒精（95%，酒精燈使用）第第 2 節(jié)節(jié)無菌操作無菌操作1. 無菌室的打掃與滅菌無菌室的打掃與滅菌1) 定期打掃無菌室：先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3新潔爾滅擦拭

4、。2) 培養(yǎng)箱定期滅菌：用 75%酒精擦拭孵箱內(nèi)部（最好同時將孵箱中各隔層4拆下） ，再用紫外燈照射。 （對于含有自動滅菌程序的孵箱，先用 75%酒精擦拭后，再啟動其滅菌程序）3) 實驗前細胞房與超凈臺的滅菌：打開紫外燈，照射 30min 左右。4) 每天實驗結(jié)束后，應(yīng)及時清理垃圾筒中垃圾。2. 實驗人員的無菌準備實驗人員的無菌準備1) 實驗前應(yīng)用肥皂洗手。2) 穿好實驗服，更換拖鞋。3) 75%酒精消毒雙手。3. 操作臺中的無菌操作操作臺中的無菌操作1) 在超凈臺經(jīng)紫外照射滅菌后，實驗人員應(yīng)注意在通風條件下在通風條件下進行實驗操作。2) 在通風條件下，先點燃酒精燈，再用酒精棉擦拭超凈臺桌面（

5、盡可能的大于自己所用臺面） ，同時保持工作區(qū)域的寬敞。3) 實驗人員應(yīng)清除無菌區(qū)與有菌區(qū)的概念。超凈臺雖經(jīng)紫外照射除菌，但也是相對的，因此，操作時應(yīng)靠近酒精燈火焰。4) 操作時應(yīng)盡量減少手臂的運動，盡可能避免左右手交叉（近手操作）：把需要有用的工具和試劑盡可能放在手邊，以酒精燈為界，左手用的東西放在酒精燈的左邊，右手用的東西放在右邊。例如，一個右手操作者要從試劑瓶里吸取液體，則移液槍應(yīng)放在右手，而槍頭與試劑瓶都應(yīng)放在左手邊。5) 帶入操作臺中的物品，應(yīng)注意：剛經(jīng)高壓滅菌的可以直接放入超凈臺中；臨時帶進來的，應(yīng)先用 75%酒精擦拭或噴灑后再放入超凈臺，這類物品包括各種裝培養(yǎng)基、緩沖鹽等的瓶子、試

6、管架、膠塞等。6) 要養(yǎng)成用鑷子操作的習慣：拿取飯盒中的各類物品，盡可能用鑷子去夾?。粚τ谛〉奈锲?，如瓶蓋、槍頭、eppendorf 管，應(yīng)避免用手直接去拿取。7) 打開的瓶子，應(yīng)放在酒精燈火焰旁，瓶蓋反放朝上。禁止禁止在打開試劑瓶包括瓶蓋的正上方進行實驗操作（包括跨越敞開的開試劑瓶上方去拿取東西） 。58) 實驗結(jié)束后，依次將個人物品帶出超凈臺（包括廢液缸） ，用酒精棉擦拭桌面，熄滅酒精燈，最后調(diào)小風力并關(guān)掉日光燈。9) 廢液的處理：先將廢液缸中的液體倒入下水道，再將廢液缸中其他東西倒入垃圾簍中（盡可能避免將大量廢液倒入垃圾簍中） 。4. 其他注意事項其他注意事項1) 保持試劑瓶與桌面成約

7、45時打開蓋子或移取液體：這樣可以盡量減少空氣的污染以及在移液時產(chǎn)生最少的氣溶膠。2) 在打開試劑瓶、拿取瓶蓋、鑷子及玻璃移液管等時都要用火燒下：灼燒不是為了滅菌，只需在火焰上燎 13 秒即可。灼燒一下瓶口和移液管等，使顆粒固定在表面和制造一個向上的氣流，以減少掉落顆粒的數(shù)量。3) 定期檢查 CO2鋼瓶的壓力。4) 定期檢查孵箱中水盤中的水量及是否污染（最好每周更換一次，用無菌水）第第 3 節(jié)節(jié)培養(yǎng)用品的清洗培養(yǎng)用品的清洗1. 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗1) 自來水或肥皂水刷洗。2) 烘干，泡酸：烤箱中烘干，浸入洗液（重鉻酸鉀 120g：濃硫酸 200ml：蒸餾水 1000ml）中，浸泡 1

8、2 小時，然后從酸缸里撈出器皿用自來水沖洗 15 次，最后蒸餾水沖洗 3-5 次和用雙蒸水過 3 次。3) 烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝，待用。2. 橡膠與塑料制品的清洗橡膠與塑料制品的清洗橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進行如下的處理程序。1) 針式濾器帽不能泡酸液：用 NaOH 泡 6-12 小時，或者煮沸 20 分鐘（指新的濾器） 。用過的濾器，每次用完后及時用自來水、蒸餾水、雙蒸水沖洗干凈，晾干就可。2) 新膠塞烘干后用 2氫氧化鈉溶液煮沸 30 分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理 30 分

9、鐘） ，自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，6再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓滅菌。3) .塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板及膠頭：用洗滌劑洗干凈后，用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，涼干。75酒精浸泡過夜，超凈臺中吹干，紫外照射后使用即可。 3. 注意事項注意事項1) 注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B. 從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。第第 4 節(jié)節(jié)培養(yǎng)用品的消毒滅菌及滅菌鍋的使用培養(yǎng)用品的消毒滅菌及滅菌鍋的使用造成組織細胞培養(yǎng)失敗的主要原因之一是發(fā)生

10、污染，特別是微生物污染。在細胞培養(yǎng)的實驗過程中，有一半以上任務(wù)是培養(yǎng)用品的消毒滅菌。防止培養(yǎng)物污染主要通過培養(yǎng)用品的消毒滅菌與實驗人員的無菌操作技術(shù)來完成。目前本實驗中采用的消毒滅菌方法主要是濕熱消毒、紫外線消毒及過濾除菌消毒。1. 濕熱消毒濕熱消毒常用且很有效的消毒方法，一般使用高壓蒸汽滅菌鍋進行。高壓蒸汽滅菌鍋裝置嚴密，輸入蒸汽不外逸，溫度隨蒸汽壓力增高而升高，當壓力增至103206kPa 時，濕度可達 121.3-132。高壓蒸汽滅菌法就是利用高壓和高熱釋放的潛熱進行滅菌。適用于耐高溫、高壓，不怕潮濕的物品，如敷料、手術(shù)器械、玻璃器皿、培養(yǎng)瓶/皿、細菌培養(yǎng)基等。1) 操作方法如下：操作方

11、法如下： 滅菌前，應(yīng)檢查滅菌鍋中的水量，保持水位高于加熱圈 2cm 左右。 將擬滅菌的物品隨同盛裝的桶放入滅菌器內(nèi)；將蓋子上的排氣軟管插于鋁桶內(nèi)壁的方管中；蓋好蓋子，擰緊元寶螺絲，勿使漏氣。 打開放氣閥，調(diào)節(jié)變壓器至 220V，開始加熱。 排出鍋內(nèi)冷空氣,關(guān)閉放氣閥（一般以空氣急速排出 2 分鐘左右為準） ，使壓力逐漸上升至 120kPa（壓力表中的指針應(yīng)在中間位置左右） ，調(diào)7節(jié)變壓器，維持壓力 30 分鐘左右。 滅菌完后，應(yīng)先關(guān)掉滅菌鍋的開關(guān)，拔掉電源插頭，再將變壓器調(diào)零。 滅菌鍋壓力降至“0”后，約 10 分鐘，再慢慢打開滅菌鍋蓋子。如果突然開蓋，冷空氣大量進入，蒸汽凝成水滴，使物品潮濕

12、，且玻璃類易發(fā)生爆裂。2) 注意事項：注意事項： 滅菌前必須檢查鍋內(nèi)水位。 滅菌時，各包裹不宜過大過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。 滅菌時，對于螺旋蓋的瓶子，應(yīng)使瓶口半松；對于膠塞的瓶子，應(yīng)插入注射器針頭，保持瓶子內(nèi)的冷空氣順利排出。滅菌完后，應(yīng)立即擰緊瓶塞或拔掉針頭（多時須貼上膠布） 。 液體滅菌時，液體體積以不超過 3/4 為宜。 針式濾器及過濾裝置，在進行高壓滅菌時，要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，濾膜光滑一面是正面，否則起不到過濾的作用。3) 不能高壓滅菌的有：不能高壓滅菌的有： 含有熱不穩(wěn)定組分，如血清、維生素、抗體和蛋白質(zhì)等（如 BSA） 。

13、 哺乳動物、植物和昆蟲的培養(yǎng)基。 含 HEPES 的溶液。 含有去垢劑的緩沖液，如 10% SDS，會因為沸騰而溢出。 含有二硫蘇糖醇（DTT）或 -巰基乙醇（BME） 。 避免物質(zhì)沉淀、變色及分解：葡萄糖不能和含有氨基酸或磷酸鹽的組分一起滅菌；磷酸鹽不能和含有氨基酸或者其他礦物質(zhì)鹽溶液（Ca2+）一起滅菌；含有礦物質(zhì)鹽的溶液不能和瓊脂一起滅菌；不要在 pH6.0 一下滅菌瓊脂溶液。2. 紫外線消毒紫外線消毒紫外線直接照射消毒是目前實驗室中常用的方法之一，主要用于實驗室房8間里的空氣、超凈工作臺、桌椅表面等消毒。同時，紫外線消毒也是我們常用于塑料培養(yǎng)皿（塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等）的消毒。3. 過濾

14、除菌消毒過濾除菌消毒對于不宜采用高壓滅菌的液體，如培養(yǎng)基、血清等，可采用過濾方法以去除細菌等微生物。本實驗室中主要采用抽濾式裝置和針孔注射式濾器兩種方法。具體采用那種方法，主要依賴于濾液的體積，對于體積較大的，如 1L培養(yǎng)基及緩沖液等，可采用抽濾式裝置，對于體積較小的（2.0，那么蛋白質(zhì)含量較高；如果1.8，那么核酸分解較多。5. 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄具體實驗步驟及采用的溫度應(yīng)參照所用逆轉(zhuǎn)錄酶的說明書和所選擇的cDNA 引物（隨機六聚體引物或 Oligo(dT)） 。以下以 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和 Oligo(dT)引物為例：反應(yīng)總體積為 50ulTotal RNA 4ugOligo(dT)18 2l

15、 輕輕混勻，70反應(yīng) 5min，冰上冷卻;補 1DEPC-treated water 至 31.75l 再按以下依次加入：22M-MLV 5buffer 10lRiboraclease inhibitor 1.25l10 nm dNTP 5l M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 2l42，60min；70，5min 得到 cDNA ,-20保存。反應(yīng)總體積為 50ulTotal RNA 4ugOligo(dT)18 2l 輕輕混勻，70反應(yīng) 5min，冰上冷卻;補 1DEPC-treated water 至 31.75l 再按以下依次加入：M-MLV 5buffer 10lRiboraclease inhi

16、bitor 1.25l10 nm dNTP 5l M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 2l42，60min；70，5min 得到 cDNA ,-20保存。6. PCRPCR 反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（10PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板）五部分組成。各個組份都能影響 PCR 結(jié)果的好壞。以下體系僅供參考。反應(yīng)體系 (30ul)Template RNA 3l10buffer 3lMg2+ 2.4ldNTP 0.6 l up primer 1ldown primer 1ldd H2

17、O 18.7lTaq polymerase 0.3l反應(yīng)條件2394 3min 1 cycle94 1min52 45sec 29 cycles72 1min72 10min 1 cycle4 （保存）對 PCR 反應(yīng)體系中主要因素的影響作一概述：1) 反應(yīng)緩沖液：一般隨 Taq DNA 聚合酶供應(yīng)。標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3 室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為 200M 時，Mg2+為1.5mM 較合適。若樣品中含 EDTA 或其它螯

18、合物，可適當增加 Mg2+的濃度。在高濃度 DNA 及 dNTP 條件下進行反應(yīng)時，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗，一般以 1.52mM（終濃度）較好。2) dNTP ：高濃度 dNTP 易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR 中常用終濃度為 50400M 的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP 能與 Mg2+結(jié)合，使游離的 Mg2+濃度降低。因此，dNTP 的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的 Mg2+濃度。3)

19、 Taq DNA 聚合酶酶：在 100l 反應(yīng)體系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以達到每 min 延伸 10004000 個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當作預(yù)試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應(yīng)體積時（如 20l 或 50l），一般酶的用量仍不小于 2U，否則反應(yīng)效率將降低。4) 模板：PCR 對模板的要求不高，單、雙鏈 DNA 均可作為 PCR 的樣品。雖然 PCR 可以用極微量的樣品（甚至是來自單一細胞的 DNA）作為摸24板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用 g 水平的

20、基因組 DNA 或104拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白，將可能干擾PCR 反應(yīng)。5) Mg2+濃度：Mg2+對 PCR 擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR 反應(yīng)中，各種 dNTP 濃度為 200mol/L 時，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L 為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。6) 溫度與時間的設(shè)置：基于 PCR 原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三

21、個溫度點。A： 變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR 失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin 足以使模板 DNA 變性，若低于 93則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或 PCR 產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致 PCR 失敗。B： 退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響 PCR 特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至 4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。引物的復(fù)性溫度可通

22、過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm 值-(35)在 Tm 值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR 反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為 3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。C： 延伸溫度與時間：PCR 反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 7075之間，常用溫度為 72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR 延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般 1Kb 以內(nèi)的 DNA 片段，延伸時間 1min 是足夠 的。34kb 的靶序列需 34min；擴增 10Kb 需延伸至 15min。延伸進

23、間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。257. 電泳電泳1) 取 50TAE 電泳液 10ml，用雙蒸水稀釋至 500ml，取一定量稀釋液加入電泳槽中。2) 鋪膠：取 1g 瓊脂糖，倒入錐形瓶中，加入 50ml 1TAE 緩沖液，電爐或微波爐中煮至沸騰。待融化的瓊脂糖溶也稍微冷卻，加入 EB 溶液，充分混勻。將熱的凝膠液倒入已放置好梳子的電泳板中，室溫放置，冷卻后拔出梳子，放入電泳槽中。3) 加樣（依據(jù)梳子大小，調(diào)節(jié)加樣量）：5l 樣品+1l 6loading buffer，混勻后依次加入孔中。4) 電泳：接上電源，調(diào)節(jié)電壓（90V）.5) 電泳約 30min

24、 后，進行紫外掃描。6) 應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳圖像進行光密度掃描分析，計算待測基因的表達量。26第第 2 節(jié)節(jié)Western blot 實驗操作實驗操作1. 試劑與配方試劑與配方7) 提取蛋白 預(yù)冷的 PBS 細胞裂解液 lysis Buffer：50mM Tris-Cl150 mM NaCl (8.775mg/ml)0.02% NaN3 (0.2mg/L)1% NP40 保存于 4，使用前加入 PMSF（有毒?。┲两K濃度 100g/ml8) SDS 聚丙烯酰胺凝膠（有毒?。㏒olution A：Acrylamide 29.2g，Bis 0.8g，加水至 100ml，避光保存于4；Sol

25、ution B：Tris Base 18.2g，SDS 0.4g，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 8.8，加水至100ml，室溫保存；Solution C：Tris Base 6.1g，SDS 0.4g，HCl 調(diào)節(jié) pH 至 6.8，加水至100ml，室溫保存；各濃度類型的 SDS 膠的配方：分離膠10%12.5%15%堆積膠Solution A (ml)3.354.1550.6Solution B (ml)2.52.52.5/Solution C (ml)/1ddH2O (ml)4.153.052.52.410% 過硫酸銨(l)40404020TEMED (l)10101010不同濃度 X分離膠的

26、配制公式：A 液 X/3ml，B 液 2.5ml，ddH2O（7.5-X/3）ml，10%過硫酸銨2750l，TEMED 10l，總量 10mlSDS-PAGE 分離膠濃度 最佳分離范圍6%膠 50150kD 8%膠 3090kD 10%膠 2080kD12%膠 1260kD 15%膠 1040kD9) 6Loading Buffer（10ml）：0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl(pH6.8)，3ml 甘油，2ml 10的 SDS，0.8ml -巰基乙醇，1ml 1溴酚藍，加蒸餾水補足 10ml。10) 考馬斯亮藍膠用染色液：0.2%考藍 G-250，40甲醇，10醋酸（可回收）

27、 。11) 脫色液：45甲醇，45去離子水，10醋酸。12) 轉(zhuǎn)移緩沖液：3.03g Tris Base，14.4g 甘氨酸，200ml 甲醇（用前加入，易揮發(fā)） ，加去離子水至 1L，于 4保存。13) 麗春紅 S 染色液：0.2%麗春紅 S，3三氯乙酸，3磺基水楊酸，室溫保存。14) 封閉液：10脫脂奶粉-PBST(Tween-20 0.01%-0.05%，用前加入)15) 抗體稀釋劑：5BSA-PBST16) 其他：顯影粉，定影粉，紅燈泡購自照相器材店；蛋白Marker，PVDF 膜（0.2m 適合 20KD 以下的蛋白） ，Whatman 濾紙，X-光片（感綠光） ，化學發(fā)光劑2. 儀

28、器儀器低溫高速離心機，恒溫水浴鍋，BIO-RAD 垂直電泳槽，搖床，暗盒，封口機，等3. 實驗步驟實驗步驟1) 提取蛋白提取蛋白 胰酶消化后，冷 PBS 輕輕蕩洗 2 次，以去除胰酶，加入適量冷 PBS吹打細胞收集至離心管中，1000rpm5min；28 棄上清，加入 1ml 冷 PBS 重懸細胞至 1.5ml 道夫管中，2000rpm5min（冷 PBS 洗細胞 23 次） ； 棄上清，加入冷的 lysis buffer（使用前加入 PMSF 至終濃度100g/ml） ，每 106細胞約加入 60l lysis buffer，在冰上孵育30min，4 12000 rpm5min。內(nèi)皮細胞長滿

29、一個 75ml 的培養(yǎng)瓶約加入 3050l 的 lysis buffer 可以看到離心管底部有粘稠的白色的沉淀，小心的吸出上清的蛋白溶液至一個新的小道夫管中，注意不要吸入沉淀。2) 蛋白定量蛋白定量（也可以用碧云天的 BCA 蛋白定量試劑盒定量）Bradford 儲存液：100ml 95乙醇，200ml 85磷酸，350mg 考藍 G。室溫下長期保持穩(wěn)定。Bradford 工作液：425ml 雙蒸水，15ml 95乙醇，30ml85磷酸，30ml Bradford 儲存液。Whatman 濾紙過濾，保存于室溫棕色瓶中，可使用數(shù)周。 精密配制 1mg/ml 的 BSAPBS 溶液； 分別吸取 0

30、，20，40，60，80，100l 的 1mg/ml 的 BSA-PBS 溶液于試管中（平行做兩組） ； 相應(yīng)加入 100，80，60，40，20，0l 的 PBS 溶液于試管中； 每管加入 1ml 的 Bradford 工作液，搖勻； 吸取 100l 于 96 孔板中測定 A595值（每管平行操作 2 次，5min 中內(nèi)完成以上操作） ； 求平均值； 做標曲； 空白 lysis buffer 10l 加入 90l 的 PBS，加入 1ml 的 Bradford 工作液，測定 A595值（每管平行操作 2 次） ； 提取的蛋白 lysis buffer 10l 加入 90l 的 PBS，加入

31、1ml 的 Bradford工作液，測定 A595 值（每管平行操作 2 次） ； 蛋白 lysis buffer 減去空白 lysis buffer 的值代入標曲求出蛋白濃度。293) 制膠和電泳制膠和電泳 根據(jù)所需濃度配制分離膠，加入玻璃板中至綠框中間，加水封住液面（加水時要輕柔，否則液面會被沖凹陷不能恢復(fù)） 。室溫靜置約40min 膠凝，此時可看到分離膠和水之間有明顯的界面。 配制堆積膠，取出水相，加入堆積膠，不要有氣泡，立刻插入梳子，待膠凝后放入電泳槽中加入電泳緩沖液，拔出梳子。 取約 3050g 蛋白樣品加入 Loading Buffer，注意每孔上樣不超過20l，在沸騰的水浴中放置

32、 510min（最好蛋白道夫管于水浴同時加熱，否則直接投入沸水中會崩開管蓋而倒置進水） 。 短暫離心，甩干管壁外水滴和甩下管壁內(nèi)的蛋白樣品。 向加樣孔中加入蛋白樣品與 Marker，不加樣的泳道加入上樣緩沖液。 樣品在濃縮膠中時用 60-80V，溴酚蘭前沿進入分離膠后用 120-150V恒壓電泳（電泳時間一般 24 h，視電壓而定） 。 當溴酚蘭前沿剛跑出凝膠時停止電泳（若是下步轉(zhuǎn)膜做大分子量的蛋白質(zhì)則等所需蛋白跑至中間停止，若是做小分子也是） 。 在有水潤濕的環(huán)境下翹開玻璃板，在膠的一端切角做記號。 考馬斯亮藍染色 4h 以上，去除染液自來水沖洗，加入脫色液搖洗，更換脫色液至膠變得透明，條帶

33、明顯。4) 轉(zhuǎn)膜（濕法）轉(zhuǎn)膜（濕法） （大轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）Transfer Buffer 置 4預(yù)冷去除氣體。 取出膠，去掉多余的膠（膠范圍最好相應(yīng)切大些） ，切角做好標記，測量大小后浸入 Transfer buffer 中 30min（大分子蛋白轉(zhuǎn)膜可省浸泡，直接做） 。 切取小于膠的小的濾紙 6 張侵入 Transfer buffer 中 15min。 剪下小于膠的大小的 PVDF 膜（只要能覆蓋所需的蛋白即可） ，與膠對應(yīng)處切角做好標記，在甲醇中浸 5min，蒸餾水浸泡洗滌使膜呈親30水狀并透明，泡入 Transfer buffer 中 15min，切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜（NC：水浸泡 2h，泡時使膜浮于水上，下層與水接觸） 。 浸泡纖維墊。 打開夾子，在黑面依次覆蓋纖維墊濾紙3膠膜（2：觀察是否穿膜，或做小分子蛋白）濾紙3纖維墊，注意不要有氣泡，壓緊（最好是膠或膜大一點，膜兩邊的濾紙一定不能相互接觸，接觸后最好是膠或膜大一點，膜兩邊的濾紙一定不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路！會發(fā)生短路?。?。 合上夾子，黑面朝向轉(zhuǎn)膜槽黑面放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)子放