顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞外基質(zhì)研究

1、    顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞外基質(zhì)研究        摘要：目的：探討兔顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位后，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中某些細(xì)胞外基質(zhì)成份的改變。方法：在建立顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過偏振光顯微鏡，改良Masson染色以及阿辛藍(lán)染色，觀察30只兔關(guān)節(jié)盤、髁狀突的膠原纖維以及糖胺多糖的變化。結(jié)果：細(xì)胞外基質(zhì)研究表明，關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后，關(guān)節(jié)盤中間帶膠原纖維明顯斷裂，雙板區(qū)出現(xiàn)含膠原纖維的假性關(guān)節(jié)盤。早期髁狀突糖胺多糖喪失，術(shù)后4周開始糖胺多糖合成增加。在關(guān)節(jié)盤穿孔的標(biāo)本

2、糖胺多糖持續(xù)減少。結(jié)論：關(guān)節(jié)盤前移位可導(dǎo)致膠原纖維破壞，糖胺多糖合成增加。發(fā)生嚴(yán)重關(guān)節(jié)軟骨破壞的病例中，糖胺多糖合成減少。關(guān)鍵詞：顳下頜關(guān)節(jié)；盤前移位；動(dòng)物模型；細(xì)胞外基質(zhì)中分類號：R782.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1005-4979(1999)03-218-04 EXTRACELLULAR MATRIX CHANGES OF THE DISC DISPLACEMENT OF TEMPOROMANDIBULAR JOINT IN ANIMAL MODELLONG Xing, LI Jin-rong， XIONG Shi-chunSchool of Stomatology, Hubei Med

3、ical University, Wuhan, China. 430079Abstract: Object： To discuss extracellular matrix changes in the temporomandibular joint of surgical induction of anterior disc displacement (ADD) in the rabbit. Methods： After surgical induction of anterior disc displacement in the rabbit, the collagenous fiber

4、bundles and glycosaminoglycans (GAGs) in the disc and condyle of thirty rabbits were determined by using circular polarizing light, modified Masson stain and Alcian blue stain.Results： Extracellular matrix changes showed that there were fragmentation of the collagen fibers in the intermediate zone o

5、f the experimental disc and the disc-like change in the posterior attachment, the loss of glycosaminoglycans (GAGs) at early stage after inducing ADD and the increased synthesis of GAGs in 4 weeks ADD group, but there was decreased synthesis of GAGs in perforation group.Conclusion: There are derange

6、ment of collagen fibers and increased synthesis of GAGs in surgical induction of anterior disc displacement in the rabbit. There are decreased synthesis of GAGs in the sample of severe arthritic changes.Key words: Temporomandibular joint; Anterior disc displacement; Animal model; Extracellular matri

7、x細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)包括不同類型的膠原蛋白，各種蛋白多糖或糖胺多糖，彈性蛋白以及一些具有粘連作用的糖蛋白。由于細(xì)胞外基質(zhì)成分的存在，細(xì)胞與細(xì)胞才能結(jié)合構(gòu)成組織，細(xì)胞外基質(zhì)的組成與表達(dá)，在生理、生化中起著重要的作用。當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)的組成與表達(dá)發(fā)生改變時(shí)，則可出現(xiàn)病理性改變。本文主要探討顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位后，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中某些細(xì)胞外基質(zhì)成份的改變。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只日本大耳白兔146月齡，23kg，5只動(dòng)物為正常對照組，其余25只隨機(jī)將一側(cè)關(guān)節(jié)作為手術(shù)組，另一側(cè)關(guān)節(jié)作為手術(shù)對照組。其中1周5只，2周組5只，4周組5只，8周組5只，12周組5只。1

8、.2建立動(dòng)物模型手術(shù)組與手術(shù)對照組動(dòng)物在手術(shù)前稱體重，耳靜脈麻醉。全麻后，消毒，鋪巾。切開手術(shù)組動(dòng)物一側(cè)關(guān)節(jié)區(qū)皮膚、皮下組織達(dá)骨膜下，用骨膜剝離器翻瓣，顯露顳骨顴突根部以及關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)前方的關(guān)節(jié)囊，用絲線垂直穿過關(guān)節(jié)盤前帶的延伸部并拉絲線向前，此時(shí)關(guān)節(jié)盤前移。將縫線穿過眶下緣中點(diǎn)前方的顴弓上，并固定1。手術(shù)對照組的手術(shù)步驟與手術(shù)組相同，不縫合關(guān)節(jié)盤前帶的沿伸部，也不將關(guān)節(jié)盤拉向前方。1.3動(dòng)物標(biāo)本處理正常對照組動(dòng)物，手術(shù)組與手術(shù)對照組動(dòng)物分別于術(shù)后1周、2周、4周、8周、12周，經(jīng)耳靜脈注射過量戊巴比妥鈉致死。將兔左、右關(guān)節(jié)區(qū)鋸成2cm3的組織塊，沖洗，用甲酸枸櫞酸脫鈣液脫鈣2周。脫鈣完畢后，用銳

9、利刀片從關(guān)節(jié)組織塊的正中矢狀面，將關(guān)節(jié)組織切成兩半。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。沿關(guān)節(jié)標(biāo)本正中矢狀面連續(xù)切片5張，切片厚度6m，分別進(jìn)行偏振光顯微鏡觀察；改良Masson染色以及阿辛藍(lán)(Alcian Blue)染色。改良Masson染色方法：石蠟切片脫蠟，蒸餾水洗，入地衣紅染色液15min，水洗后再入蘇木素染液2min，鹽酸分化，水洗顯藍(lán)后，入麗春紅液3min，水洗。入亮綠染液2min，脫水，透明，封固。染色結(jié)果顯示：膠原纖維呈綠色，彈力纖維呈棕色，纖維素呈紅色。阿辛藍(lán)染色方法： 5%阿辛藍(lán)醋酸緩沖液(pH5.8)100ml加入0.4mol/L MgCl2。切片脫蠟至水加入上液后過夜，

10、水洗，脫水，透明，封片。結(jié)果顯示硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素呈藍(lán)色。 5%阿辛藍(lán)醋酸緩沖液(pH 5.8)100ml加入0.9mol/L MgCl2。切片染色方法同上。結(jié)果顯示：硫酸角質(zhì)素呈藍(lán)色。2結(jié)果2.1偏振光顯微鏡觀察正常對照組：可見關(guān)節(jié)盤中間帶粗大的膠原纖維束呈連續(xù)的前后走向，在前后帶見膠原纖維束呈內(nèi)外走向的橫斷面。髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)表面有一層連續(xù)狹窄的細(xì)纖維折射帶(1)。手術(shù)對照組與正常對照組相同。1兔正常顳下頜關(guān)節(jié)偏振光示關(guān)節(jié)盤中間帶前后走向，連續(xù)的纖維折射。(偏振光10×)手術(shù)組：25側(cè)中有6側(cè)出現(xiàn)關(guān)節(jié)盤穿孔，其余關(guān)節(jié)盤前移位。關(guān)節(jié)盤前移位的標(biāo)本術(shù)后1，2，4周，中間帶斷裂呈鱗

11、片狀，后帶出現(xiàn)前后走向的纖維折射，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)表面纖維連續(xù)，髁狀突部分纖維裂(2)。術(shù)后8周，中間帶膠原纖維斷裂，髁狀突及關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)纖維變粗。術(shù)后12周，關(guān)節(jié)盤膠原纖維斷裂變形，髁狀突及關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)部分區(qū)域膠原纖維增厚(3)。關(guān)節(jié)盤穿孔的標(biāo)本，髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)表面纖維消失。2顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后1周，關(guān)節(jié)盤中間帶呈點(diǎn)狀纖維折射。(偏振光10×)3顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后12周，關(guān)節(jié)盤膠原纖維斷裂變形。(偏振光10×)2.2Masson染色正常對照組與手術(shù)對照組見髁狀突表面纖維層，未分化間充質(zhì)細(xì)胞層，關(guān)節(jié)盤中間帶，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)纖維層以及滑膜染成紅色。關(guān)節(jié)盤前后帶，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)軟骨樣骨以及髁狀突

12、軟骨細(xì)胞層染成綠色(4)。4兔正常髁狀突功能區(qū)。(Masson染色50×)術(shù)后1周組，髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)綠染明顯減少，部分區(qū)域消失，滑膜增厚，雙板區(qū)彈力纖維與膠原纖維增多組織致密。術(shù)后2周組，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)與滑膜改變同術(shù)后1周組，關(guān)節(jié)盤穿孔標(biāo)本髁狀突部分區(qū)域綠染增加。術(shù)后4周組，髁狀突及關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)綠染明顯增多，雙板區(qū)似盤樣變(5)。術(shù)后8周組，髁狀突功能區(qū)綠染減少，髁狀突前緣，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)后斜面綠染增多，滑膜增厚，雙板區(qū)纖維松解斷裂(6)。術(shù)后12周組，髁狀突表面紅染減少，部分區(qū)域消失，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)頂綠染消失，雙板區(qū)致密組織明顯增厚。5顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后4周，雙板區(qū)關(guān)節(jié)盤樣變，綠染明顯增多。(Ma

13、sson染色25×)6顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后8周，關(guān)節(jié)盤雙板區(qū)棕色的彈力纖維與綠色的膠原纖維出現(xiàn)疏松、斷裂(Masson 25×)2.3阿辛藍(lán)染色：正常對照組與手術(shù)對照組0.4mol/L MgCl2濃度，髁狀突軟骨細(xì)胞層著色明顯，功能區(qū)與非功能區(qū)染色一致(7)。0.9mol/L MgCl2濃度髁狀突、關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)、關(guān)節(jié)盤著色均較淡。7兔正常顳下頜關(guān)節(jié)阿辛藍(lán)0.4M MgCl2濃度染色，見髁狀突功能區(qū)，非功能區(qū)有均勻一致的藍(lán)染。(Alcain Blue 10×)0.4mol/L MgCl2濃度術(shù)后1周組，髁狀突軟骨細(xì)胞層著色變淺，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)著色加深。術(shù)后2周組，關(guān)節(jié)盤前移

14、位標(biāo)本髁狀突功能區(qū)部分著色加深，部分區(qū)域無染色(8)，功能區(qū)比非功能區(qū)染色淡，關(guān)節(jié)盤后帶以及與后帶相對的關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)著色加深。關(guān)節(jié)盤穿孔標(biāo)本髁狀突功能區(qū)與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)染色淺。術(shù)后4周組，關(guān)節(jié)盤前移位標(biāo)本髁狀突功能區(qū)與關(guān)節(jié)盤染色加深(9)。關(guān)節(jié)盤穿孔與術(shù)后2周組相同。術(shù)后8周組，關(guān)節(jié)盤前移位標(biāo)本髁狀突功能區(qū)染色比非功能區(qū)淺，關(guān)節(jié)盤穿孔標(biāo)本髁狀突功能區(qū)與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)染色極淡，術(shù)后12周組與術(shù)后8周相同。0.9mol/L MgCl2濃度關(guān)節(jié)標(biāo)本手術(shù)組均較對照組著色淺，術(shù)后2、4、8、12周關(guān)節(jié)盤前移位標(biāo)本，在關(guān)節(jié)盤、關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)，髁狀突表面出現(xiàn)著色。8顳下頜關(guān)節(jié)盤前移術(shù)后2周，髁狀突部分區(qū)域藍(lán)色喪失。(Alcain

15、 Blue 25×)9顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位4周，關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)后斜面、關(guān)節(jié)盤后帶著色加深。(Alcain Blue 10×)3討論顳下頜關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維，通過交聯(lián)、編織形成一個(gè)膠原纖維三維立體空間網(wǎng)、蛋白多糖大分子聚合物纏繞在膠原纖維網(wǎng)上，占據(jù)基質(zhì)間隙。蛋白多糖大分子聚合物是由核心蛋白連接無數(shù)糖氨多糖形成鏈，再由透明質(zhì)酸將許多核心蛋白連接則形成蛋白多糖。由于蛋白多糖是具有高度親水性的大分子物質(zhì)，在軟骨中受到膠原纖維網(wǎng)的限制而形成靜水區(qū)，使膠原纖維網(wǎng)處于持續(xù)的張力2，這種張力與外部的壓力保持一定的平衡。正常顳下頜關(guān)節(jié)髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)

16、軟骨中主要有型與型膠原，型膠原分布在增殖帶與纖維帶，型膠原存在于軟骨基質(zhì)中，關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞周圍有型膠原。Mills3在對正常兔顳下頜關(guān)節(jié)盤的偏振光顯微鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，兔的關(guān)節(jié)盤與人以及猴關(guān)節(jié)盤的結(jié)構(gòu)相似，即中間帶是前后走向粗大的膠原纖維并與內(nèi)外走向的前、后帶膠原纖維束相交叉。本文正常對照組與手術(shù)對照組偏振光顯微鏡的觀察結(jié)果與Mills研究結(jié)果一致。同時(shí)在髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)的表面也發(fā)現(xiàn)一層薄的膠原纖維折射帶。本文關(guān)節(jié)盤前移位的標(biāo)本中，致密呈前后走向排列的中間帶膠原纖維出現(xiàn)松解、斷裂，成點(diǎn)狀、鱗片狀，關(guān)節(jié)盤后帶以及雙板區(qū)出現(xiàn)粗大前后走向的膠原纖維。在正常顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)型膠原含量很少，而在顳下頜

17、關(guān)節(jié)功能紊亂的病例中，雙板區(qū)發(fā)現(xiàn)有大量的型膠原4。在靈長類動(dòng)物的顳下頜關(guān)節(jié)雙板區(qū)中沒有發(fā)現(xiàn)型膠原，只在關(guān)節(jié)盤中發(fā)現(xiàn)有型和型膠原5。本文在關(guān)節(jié)盤后帶以及雙板區(qū)出現(xiàn)粗大膠原纖維，說明關(guān)節(jié)盤與雙板區(qū)的膠原纖維類型發(fā)生了變化。Salo等6用果莫里氏網(wǎng)狀細(xì)胞染色(Gomori's reticularstain)的方法在顳下頜關(guān)節(jié)病的髁狀突中發(fā)現(xiàn)，型膠原存在于改建的骨組織以及新生的軟骨骨樣組織。在顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂的中期階段，型膠原主要存在于修復(fù)的纖維組織中，也出現(xiàn)在髁狀突軟骨修復(fù)的部位。本文中關(guān)節(jié)盤前移位與穿孔的早期，髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)表層正常的一層薄纖維折射帶出現(xiàn)斷裂甚至部分消失。到后期(8、1

18、2周)，髁狀突與關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)表面出現(xiàn)增厚的折射帶，可能與顆狀突關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)有關(guān)。本文Masson染色中發(fā)現(xiàn)，兔關(guān)節(jié)盤前移位后髁狀突關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)在早期綠染減少，說明膠原纖維以及軟骨細(xì)胞相應(yīng)減少。從術(shù)后4周開始髁狀突綠染增加，可能與軟骨細(xì)胞，膠原纖維，蛋白多糖的合成增加有關(guān)。在雙板區(qū)由正常綠色和棕色交雜的疏松結(jié)締組織，變成增厚致密的綠染關(guān)節(jié)盤樣組織，部分標(biāo)本可以見到棕色的彈力纖維與綠色的膠原纖維發(fā)生斷裂。這種改變可能是顳下頜關(guān)節(jié)超負(fù)荷時(shí)由未分化間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的型膠原代替了型膠原和彈力纖維。關(guān)節(jié)軟骨中的糖胺多糖主要包括硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素。用阿辛藍(lán)染色的方法，觀察人類關(guān)節(jié)盤與髁狀突糖胺多糖的分布發(fā)現(xiàn)，硫

19、酸軟骨素與硫酸角質(zhì)素存在于下頜髁狀突的軟骨細(xì)胞層和關(guān)節(jié)盤的負(fù)重區(qū)。硫酸角質(zhì)素位于成熟的成軟骨細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)中，硫酸軟骨素位于關(guān)節(jié)軟骨的深層，硫酸角質(zhì)素與硫酸軟骨素在關(guān)節(jié)盤軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞周圍5。有報(bào)道表明，關(guān)節(jié)軟骨與關(guān)節(jié)盤纖維軟骨中硫酸角質(zhì)素比硫酸軟骨素含量低7。所以在阿辛藍(lán)染色中，0.9mol/L MgCl2濃度的著色很淡。Ali等7發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后2周的動(dòng)物標(biāo)本，關(guān)節(jié)軟骨、糖胺多糖開始明顯喪失。本文動(dòng)物實(shí)驗(yàn)術(shù)后1、2周髁狀突軟骨細(xì)胞層阿辛藍(lán)染色明顯變淡，說明糖胺多糖喪失。這種糖胺多糖的喪失是由于合成降低而降解增加。型膠原的破壞和分解是引起糖胺多糖喪失的原因，因?yàn)樘前范嗵窃邝翣钔卉浌?/p>

20、細(xì)胞層中，纏繞在型膠原上。另外糖胺多糖的喪失還與金屬蛋白酶有關(guān)。軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞受細(xì)胞因子刺激而分泌金屬蛋白酶，金屬蛋白酶使糖胺多糖降解的部位發(fā)生在透明質(zhì)酸結(jié)合區(qū)以及核心蛋白的硫酸軟骨素區(qū)。在關(guān)節(jié)負(fù)荷增加的情況下，糖胺多糖的合成可伴隨修復(fù)反應(yīng)而增加，Ali等7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)盤前移位術(shù)后6周關(guān)節(jié)軟骨糖胺多糖合成增加。雙板區(qū)糖胺多糖明顯增加使其呈假性關(guān)節(jié)盤。這種合成的增加是由于關(guān)節(jié)組織進(jìn)行重建，但并不是所有軟骨細(xì)胞都有能力再生，而且新合成的糖胺多糖比正結(jié)構(gòu)常短，相對來說功能就差一些。本文關(guān)節(jié)盤前移位的標(biāo)本，在術(shù)后4周糖胺多糖增加，但關(guān)節(jié)盤穿孔的標(biāo)本糖胺多糖的喪失明顯，而且在術(shù)后12周仍未

21、見糖胺多糖的增加。說明在發(fā)生嚴(yán)重關(guān)節(jié)軟骨破壞的病例中，糖胺多糖合成減少。作者簡介：龍星(1957-)，男，博士，副教授作者單位：湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院(430070)參考文獻(xiàn)：1龍星，李金榮.顳下頜關(guān)節(jié)盤前移位的動(dòng)物模型.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1998，15：184.2DeBont LGM, Stegenga B. Pathology of temporomandibular joint internal derangement and osteoarthrosis. Int J Oral Maxillofac Sur, 1993,22:71.3Mills DK, Daniel JC, Scapino R. Histological features and in vitro proteoglycan synthesis in the rabbit craniomandibular join