腫瘤動(dòng)物模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、腫瘤動(dòng)物模型得建立可以：作為抗腫瘤藥物篩選模型；為腫瘤轉(zhuǎn)移研究提供更好得研究平臺(tái)；為研發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移性藥物提供良好得實(shí)驗(yàn)工具。實(shí)驗(yàn)方法：誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)方法原理： 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型就是指研究者用化學(xué)致癌劑、 物得腫瘤等。實(shí)驗(yàn)材料：腫瘤細(xì)胞小鼠 試劑、試劑盒、無(wú)血清培養(yǎng)基質(zhì)、3%中性甲醇石臘儀器、耗材、低溫離心機(jī)、血球計(jì)數(shù)器、游標(biāo)卡尺 實(shí)驗(yàn)步驟、肝癌1二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大白鼠肝癌1)取體重250 g左右得封閉群大白鼠，雌雄不拘；(2)按性別分籠飼養(yǎng)。除給普通食物外，飼以致癌物，即用0、25%DEN水溶液灌胃，劑量為10 mg/kg，每周一次，其余5天用0、025%DEN水溶液放入水

2、瓶中，任其自由飲用；3)共約4個(gè)月可誘發(fā)成肝癌；4)也可以單用0、005%摻入飲水中口吸服8個(gè)月誘發(fā)肝癌。24-2甲基氨基氮苯(DBA)誘發(fā)大鼠肝癌(1)用含0、06%DBA得飼料喂養(yǎng)大鼠，飼料中維生素B2不應(yīng)超過(guò)1、52 mg/kg;(2)46月就有大量得肝癌誘發(fā)成功。32-乙酰氨基酸(2AAF)誘發(fā)小鼠、狗、貓、雞、兔肝癌(1)給成年大鼠含0、03% 2AAF標(biāo)準(zhǔn)飼料;(2)每日每平均23 mg 2AAF(也可將2AAF混于油中灌喂)，34月后有8090%動(dòng)物產(chǎn)生肝腫瘤。1)評(píng)價(jià)抗腫瘤免疫治療得療效；放射線、 致癌病毒誘發(fā)動(dòng)4二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌：(1)用劑量為每日0、314 mg/k

3、g體重，混于飼料或飲水中給予;(2)69個(gè)月后255/300大鼠發(fā)生了肝癌。5.亞胺基偶氮甲苯(OAAT誘發(fā)小鼠肝癌(1)用1%OAAF苯溶液(約0、1 ml含1 mg)涂在動(dòng)物得兩肩胛間皮膚上，隔日一次，每 次23滴,一般涂100次。2)實(shí)驗(yàn)后78周即而出現(xiàn)第一個(gè)肝腫瘤,7個(gè)月以上可誘發(fā)小鼠肝腫瘤約55%。(3)或用2、5 mg OAAT溶于葵瓜子油中，給C3H小鼠皮下注射4次，每日間隔10天，也 可誘發(fā)成肝癌。6黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌(1)每日飼料中含0、0010、015 ppm,混入飼料中喂6個(gè)月后,肝癌誘發(fā)率達(dá)80。二、胃癌1甲基膽蒽誘發(fā)小鼠胃癌1)取20 g左右得小鼠,無(wú)菌手術(shù)下,在腺

4、胃粘膜面穿掛含甲基膽蒽(MC)線結(jié)。(2)含MC得線結(jié)就是用普通細(xì)線,在一端打結(jié)后,將線結(jié)置于盛有 在酒精燈上微微加溫,使MC液化滲入線結(jié)。MC濃度為0、050、MC小玻璃試管內(nèi),1 g 20-甲基膽蒽內(nèi)浸入1020根線。3)手術(shù)埋線后48個(gè)月可誘發(fā)成功胃癌。2不對(duì)稱亞硝胺誘發(fā)小鼠胃癌劑量為0、25 ml/kg體重,3個(gè)月后全部動(dòng)物發(fā)生前胃乳頭狀癌,78個(gè)月后有85100%發(fā)生前胃癌。昆明種最敏感。A系次之，615系小鼠敏感性最差。3甲基亞硝基醋酸尿素誘發(fā)小鼠胃癌給BD大鼠飲水中加甲基亞硝基醋酸尿素，劑量為2 mg/kg體重，每周飲用5次，520天后全部大鼠均發(fā)生了腺胃癌。三、食管癌1.甲基芐

5、基亞硝胺(MBNA)誘發(fā)大鼠食管癌1)取體重100 g以上得Wistar大鼠;2）任其食用含甲基芐基亞硝胺得飲水， 并將MBNA摻入飼料中使每日攝入量達(dá)5 mg/kg體重；3）80100天可誘發(fā)成食管癌。2二烴黃樟素（Dihydrosafrole）誘發(fā)大鼠食管癌1）二烴黃樟素就是一種制備啤酒得調(diào)味品，在大鼠飼料中加入百萬(wàn)分之二千五百至一萬(wàn)250010000 ppm）黃樟素，就能引起2075%得食管癌。3甲基芐基亞硝胺誘發(fā)大鼠食管癌（1）用0、2%或0、005%得甲基芐基亞硝胺水溶液，給動(dòng)物經(jīng)口灌喂，每天一次，大鼠灌 注劑量為1 mg/kg體重；（2）至第27天即發(fā)現(xiàn)一例食管乳頭狀瘤，154天發(fā)

6、現(xiàn)第一例食管癌，11個(gè)月食管癌得發(fā)生率為53%。四、肺癌1二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)小鼠肺癌（1）小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次劑量56 mg/kg , DEN總劑量達(dá)到868 mg;0、751、2）觀察時(shí)間為100天左右時(shí)，發(fā)癌率可達(dá)40%。（3）DEN總劑量達(dá)到1176 mg，觀察時(shí)間為半年左右時(shí)；發(fā)癌率可達(dá)94%。2烏拉坦誘發(fā)肺腺癌（1）小鼠（A系，111/2月齡）較大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%烏拉坦生理鹽水液0、10、3 ml，間隔35日再注，共注23個(gè)月，每只小鼠用量約為100 mg；2）注后3個(gè)月肺腺癌發(fā)生率為100%，而且多數(shù)為多發(fā)性，這種誘發(fā)瘤為良性。3苯并芘

7、誘發(fā)肺腺癌（1）猴氣管內(nèi)注入3，4-苯并芘共10次；（苯并花為315 mg與等量之Fe2O3混合液），每周一次,2）6只猴中有2只誘發(fā)肺得鱗狀上皮癌。4硫酸銨氣溶膠誘發(fā)肺腺癌1）用硫酸胺氣溶劑給100只大鼠吸入；2）13個(gè)月后所有大鼠都發(fā)生了肺腺癌。以附有0、1mgMC得棉紗線結(jié)在動(dòng)物不麻醉得狀態(tài)下,借助于陰道擴(kuò)張器 將線穿入宮頸。 經(jīng)右宮角背部穿出,使線結(jié)固定于宮頸口。 線得另一端則固 縫合皮膚,掛線以后,同日開(kāi)始連續(xù)注射青霉素23天。以防術(shù)后感染。10%福爾馬林固定,石蠟包埋,連續(xù)切片。七、結(jié)腸癌1.二甲基芐肼(Dimethlhydrazine，DMH)誘發(fā)鼻咽癌(1)給四周齡得雄性大白鼠

8、，皮下注射二甲基芐肼(Dimethlhydrazine,DMH)每周一次,連續(xù)21周，每次DMH21mg/kg；5甲基膽蒽誘發(fā)肺腺癌(1)用0、2%明膠作懸浮劑將甲基膽蒽混合后給金地鼠氣管內(nèi)注入，每次 膽蒽5 mg)每周一次，共6次；0、1 ml(含甲基2)53周后有62、5%動(dòng)物發(fā)生了肺癌。五、鼻咽癌1二甲基膽蒽(MC)誘發(fā)大鼠鼻咽癌(1)取直徑23 mm得硬質(zhì)塑米管，在酒精燈上小火拉成錐形，每段長(zhǎng)約 填以結(jié)晶體MC。3、5 cm,管內(nèi)2)小管一端用火封閉，以防藥物外溢，尖端用針刺數(shù)孔，使MC能從小妃溢出。(3)取體重120 g左右得大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，由前鼻孔將上述含MC得塑料小

9、管插入鼻腔,利用前鼻孔較小管粗端為小得特點(diǎn),稍加用力,迫使小管全部進(jìn)入鼻腔內(nèi), 其尖部可達(dá)鼻咽腔。不需另加固定,即可使小管長(zhǎng)期留于鼻腔內(nèi)。(4)待到預(yù)定時(shí)間(半年以上),或動(dòng)物自行死亡時(shí),到其鼻咽部, 脫鈣后,石蠟包埋,進(jìn)行連續(xù)切片。發(fā)癌率可達(dá)60%以上。10%福爾馬林固定,2二乙基亞硝胺滴鼻法誘發(fā)鼻咽癌(1)取120 g左右大白鼠,雌雄均可,乙醚麻醉后,用磨平針尖得 輕插入,針尖可達(dá)鼻咽腔；8號(hào)針頭,從前鼻孔輕(2)經(jīng)注射器灌注用1%吐溫-80新配得33、3%DEN混懸液0、0 2 ml(含DEN 6 7 mg)每周1次,共1520次,可誘發(fā)成鼻咽癌。六、宮頸癌1二甲基膽蒽(MC)誘發(fā)宮頸取

10、雌性小白鼠,及磨純得彎針,定于背部肌肉,至一定時(shí)間(半年左右)處死動(dòng)物,宮頸組織用腫瘤多發(fā)生于遠(yuǎn)隔作用部位得器官如膀胱、肝等;有明顯得種屬差異;其本身不就是直接致癌物，致癌就是由于其某種代謝產(chǎn)物得作用;（5）其致癌作用往往受營(yíng)養(yǎng)或激素得影響，例如，奶黃僅在以缺少蛋白質(zhì)與核黃素得飼料 喂飼大鼠時(shí)才引起肝癌，而且雄性大鼠較敏感，鄰位氨基偶氮甲苯則易起雌性大鼠得肝癌。2亞硝胺類得致癌特點(diǎn)1）致癌性強(qiáng)，小劑量一次給藥即可致癌;（2）對(duì)多種動(dòng)物（包括猴、豚鼠等不易誘發(fā)腫瘤得動(dòng)物）得許多器官（包括食管、腦、鼻 竇等不易引起癌得器官）能致癌，甚至可以通過(guò)胎盤(pán)致癌，如給懷孕大鼠以二乙基亞硝胺 （Diethy

11、lnitrosamine,DEN）可比較快地引起仔鼠得神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤;（3）具有不同結(jié)構(gòu)得亞硝胺有明顯得器官親與性，例如二甲基亞硝胺等對(duì)稱得衍生物常引 起肝癌， 不對(duì)稱得亞硝胺如甲基芐基亞硝胺常誘發(fā)食管癌; 在大鼠， 二丁基亞硝胺能引起膀 胱癌，二戊基亞硝胺能誘發(fā)肺癌，而N-甲基-N-硝基-N-1-亞硝基胍則能引起胃腸癌。3黃曲霉毒素得致癌特點(diǎn)（2）最后一次給藥后14周，處死動(dòng)物;（3）降結(jié)腸部位用Bouin液固定，脫水，石蠟包埋，切片。所用之 含400 mg得母液，并加EDTA37 mg用氫氧化納（0、DMH先配成每100 ml1 N）液將pH調(diào)至6、5備用。注意事項(xiàng)1要設(shè)計(jì)不同得實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組動(dòng)物數(shù)一般為5-10只;2一般接種腫瘤6-8周后，小鼠得腫瘤可生長(zhǎng)至直徑為 可眼球取血，分離血清并保存血清，織切片（或-80 C保存）,作相應(yīng)得免疫組織化學(xué)染色， 石臘包埋，作常規(guī)HE染色。15-20mm （即小鼠會(huì)瀕臨死亡）時(shí)，處死小鼠，取腫瘤組織照相， 取部分腫瘤組織作冰凍組取部分腫瘤組織用3%中性得甲醛固定，其她1芳香胺及偶氮染料類致癌物得特點(diǎn)1) 通常需要長(zhǎng)期、大量給藥才能致癌;（1）黃曲霉毒素得毒性很強(qiáng)，很小劑量（1mg/kg體重）即可使狗、幼齡大鼠、火雞或小鴨 致死;（2）其致癌性也極強(qiáng)，最小致癌劑量比亞硝胺還要小數(shù)十倍，就是已知化學(xué)致癌物中作用 最強(qiáng)者； （3）它