缺氧誘導(dǎo)因子-1α在鹽酸川芎嗪預(yù)處理的大鼠缺血再灌注腦組織中的

1、缺氧誘導(dǎo)因子-1在鹽酸川芎嗪預(yù)處理的大鼠缺血再灌注腦組織中的        【摘要】  目的研究缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）在缺血再灌注腦組織中的表達。方法應(yīng)用Realtime PCR方法，對HIF-1在鹽酸川芎嗪預(yù)處理的大鼠缺血再灌注腦組織中的表達進行檢測。結(jié)果缺血再灌注組、假手術(shù)組和用藥組中HIF-1的mRNA的表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論缺血缺氧并非在基因轉(zhuǎn)錄水平對腦組織HIF-1的表達進行誘導(dǎo)。 【關(guān)鍵詞】  缺氧誘導(dǎo)因子-1 缺血再灌注 腦組織 基因表達缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是

2、一種隨著細胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達的快速轉(zhuǎn)錄因子，因其可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞因子、促紅細胞生成素及誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶等靶基因的轉(zhuǎn)錄，而成為低氧應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控中心。作為缺血性疾病的一種候選基因，HIF-1在缺血性疾病中具有極大的應(yīng)用價值1，近年來已成為缺血性腦血管病的一個研究熱點。但腦組織發(fā)生缺血再灌注后HIF-1在基因水平的表達和特點，以及中藥對其表達的調(diào)控作用，國內(nèi)外鮮見報道。本研究利用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察局灶性缺血再灌注對HIF-1表達的影響及中藥對其表達的調(diào)控，探討其在腦缺血再灌注發(fā)生后的表達。1  材料與儀器1.1  動物SD大鼠，雌雄不限，體重（30

3、0±20） g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。1.2  試劑與儀器RevertAid TMFirst strand cDNA Synthesei Kit（Fermentans）；DR001AM Kit（TakaRa）；PTC-225 Peltier Thermal cycler PCR儀（MJ Research）；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler熒光定量PCR儀（Corbett Reseach，Australia.）；Rotor-Gene 6.0分析軟件。2  方法2.1  動物分組及造模大鼠隨機

4、分為缺血再灌注組、假手術(shù)組和用藥組，每組10只。用藥組于術(shù)前3 d開始，每天按8 mg/100 g體重腹腔注射鹽酸川芎嗪，其余兩組腹腔注射相應(yīng)體積生理鹽水。實驗第4天采用Longa2頸外動脈線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅分離血管和神經(jīng)，不插入線栓。用藥組于缺血10 min后按8 mg/100 g體重腹腔注射鹽酸川芎嗪，缺血再灌注組和假手術(shù)組于同樣時間腹腔注射相應(yīng)體積的生理鹽水。2.2  標本制取于預(yù)定時間，以10%水和氯醛再次麻醉動物，37生理鹽水250 ml經(jīng)左心室灌注沖洗，直至右心耳流出清亮液體。大鼠斷頭后快速于冰盤上取出全腦，用錫箔包裹后置于液氮中保存。2

5、.3  Real-Time PCR方法檢測2.3.1  總RNA提取稱取組織0.1 g放入裝有1 ml Trizol的10 ml離心管中，在冰浴條件下勻漿至組織完全呈粉末狀。加入200 ml氯仿，用力顛倒混勻，室溫靜置10 min，于4，13 000 r/min離心30 min，從每管中吸取上清液至另一1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后-20沉淀1 h。再次于4，13 000 r/min離心20 min，棄去上清液。加入500 l 75乙醇，洗滌沉淀。于4，13 000 r/min離心10 min，棄上清液。加入10 l DEPC-Water至完全溶解，進行電泳

6、并進行紫外分析測定。2.3.2  RNA樣品反轉(zhuǎn)錄利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：TaKaRa Taq（5 U·l-1），0.13 l；10×Buffer，2.5 l；MgCl2，1.5 l；Dnip Mixture，2 l；Primer 1（20 m），0.5 l；Primer 2（20 m），0.5 l；DdH2O，加至25 l。反應(yīng)按照以下過程進行： 95，2 min； 95，15 s；60，20 s；72，20 s；步驟為40個循環(huán)。1         2.

7、3.3  熒光定量PCR 引物序列（HIF-1：5'GCTCCGCCAACTCTCCCTTCC3'，5'GCTCCTGCCTCTAGTCTCC ACC3'），由上海歐易生物有限公司合成。    PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇反應(yīng)產(chǎn)物專一，沒有二聚體等雜帶的樣品進行下一步定量PCR反應(yīng)。    標準曲線制備：將預(yù)試驗的PCR產(chǎn)物以10倍濃度梯度進行稀釋，選擇1/10 000，1/100 000，1/1 000 000，1/10 000 000濃度的稀釋產(chǎn)物作為標準品模版，進行

8、熒光定量PCR反應(yīng)，并同時在熒光定量PCR儀中輸入以上4個濃度梯度的濃度數(shù)值。通過這四個標準品生成的反應(yīng)數(shù)據(jù)，軟件Rotor-Gene 6.0根據(jù)反應(yīng)的熒光實時監(jiān)控數(shù)據(jù)和標準品的濃度關(guān)系，生成標準曲線。利用此標準曲線來在標準曲線所劃定的Ct值。    熒光定量PCR 反應(yīng)：利用SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time） kit進行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq，10.0 l；Primer 1，0.4 l；Primer 2，0.4 l；DdH2O，8.2 l。PCR反應(yīng)條件：95，2 min；95，

9、15 s；58，20 s；72，20 s；步驟為40個循環(huán)。實驗結(jié)果利用軟件Rotor-Gene 5.0以及 Excel 7.0進行數(shù)據(jù)分析處理。2.4  統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析，P0.05為有差異即有統(tǒng)計學(xué)意義。3  結(jié)果3.1  繪制標準曲線 以不同定量模板起始拷貝濃度的對數(shù)為橫坐標， 以Ct值即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為縱坐標，得到標準曲線（見圖1），r=0.999 92，符合要求。圖1  標準曲線（略）3.2  實時熒光定量PCR測定結(jié)果不同腦組織中H

10、IF-1，18SrRNA的Ct值分別見圖23，從圖中可以觀察到各樣品中HIF-1的PCR反應(yīng)的變化趨勢，根據(jù)不同腦組織中HIF-1，18SrRNA的Ct值，從標準曲線上計算出各樣品的起始拷貝數(shù)，進而計算出目標基因和內(nèi)參基因起始拷貝數(shù)的比值用于進行統(tǒng)計分析。統(tǒng)計結(jié)果表明，各組HIF-1 mRNA的表達無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。圖2  不同腦組織的HIF-1 Ct值（略）圖3  不同腦組織中18 S rRNA Ct值（略）4  討論    HIF- 1是在缺氧誘導(dǎo)的細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，是被公認的缺氧調(diào)節(jié)中的重要因子3，能與靶基

11、因結(jié)合，使機體對缺氧、缺血產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)。HIF-1由、兩個亞基組成，其中亞基是其主要活性單位，HIF-1的生物效應(yīng)是由HIF-1亞基實現(xiàn)的4。 正常情況下，HIF-1不表達或表達很少，而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1的表達可呈時間和缺氧程度的依賴性升高，HIF-1蛋白的表達量和轉(zhuǎn)錄活性主要受細胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)。HIF-1通過調(diào)節(jié)其靶基因如內(nèi)皮素1、促紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等基因來發(fā)揮作用5。目前認為缺氧條件下HIF-1表達量增加的調(diào)節(jié)并不在HIF-1 mRNA水平，而是在HIF-1蛋白翻譯后水平，即通過增加HIF-1蛋白的穩(wěn)定性，抑制其降解來實現(xiàn)的6。 

12、60;  本研究結(jié)果表明，缺血再灌注組、假手術(shù)組和用藥組HIF-1的mRNA表達無明顯變化，提示缺血缺氧并非在基因轉(zhuǎn)錄水平對腦組織HIF-1的表達進行誘導(dǎo)。    目前已有不少學(xué)者就HIF-1在腦缺血再灌注時的表達進行了研究，但在基因水平的研究尚為數(shù)不多。本實驗運用Realtime PCR方法檢測了HIF-1在鹽酸川芎嗪預(yù)處理的大鼠缺血再灌注腦組織中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，為研究HIF-1在腦缺血再灌注時的表達提供了重要實驗思路和手段?！尽?#160; 1 譚新杰,胡長林. 缺氧誘導(dǎo)因子-1基因在成年大鼠局灶性腦缺血中的作用研究J.中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(15)：1060.2 Longa E Z, Weinstein P R, CarSon S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without cranitetory in ratsJ. Stroke, 1989, 20(1): 84.3 張 薇,李若溪,許建華,等. 低氧條件下大鼠視網(wǎng)膜HIF-1及P53的表達及相關(guān)分析J.國際眼科雜志,2006,6(4): 795.4 趙榮瑞. 缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的基礎(chǔ)研究與臨床意義J.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,37(3):226.5