苯甲醇對(duì)紅細(xì)胞凍干前海藻糖負(fù)載紅細(xì)胞影響研究 (8)

1、Survivin在白血病細(xì)胞中的表達(dá)及GMCSF對(duì)其影響的研究作者：吳耀輝 作者單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所，武漢 430022 【摘要】 本研究旨在探討凋亡存活蛋白survivin在白血病的原代細(xì)胞和白血病細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并觀察粒巨噬細(xì)胞細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)對(duì)其的影響。用RTPCR方法檢測(cè)37例白血病患者、10例正常成人骨髓和3種白血病細(xì)胞系（K562、HL60、U937）中survivin的表達(dá)。以HL60細(xì)胞為對(duì)象，加入合適濃度的GMCSF，用RTPCR和Western blot分別檢測(cè)加藥前后surivin mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果顯示： 3

2、7例白血病患者中有25例表達(dá)survivin，陽(yáng)性率為67.6%，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為73.3%，高于急性髓系白血病(AML)，但均高于正常對(duì)照組（20.0%）(P<0.05)。 3種細(xì)胞系K562、HL60和U937全部表達(dá)survivin。合適濃度的GMCSF作用2天后，HL60細(xì)胞中survivin的表達(dá)明顯升高，其中mRNA水平升高了26%，蛋白水平升高了49%。結(jié)論： suvivin在白血病的原代細(xì)胞和細(xì)胞系中均有較高表達(dá)，而GMCSF能顯著提高HL60細(xì)胞中survivin的水平。 【關(guān)鍵詞】 白血病細(xì)胞 survivi

3、n 粒巨噬細(xì)胞細(xì)胞集落刺激因子 Expression of Survivin in Leukemia Cells and Influence on It by GMCSF WU YaoHui, ZOU Ping, LIU Fang, SHEN HanBing Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China Abstract This study was aimed to explo

4、re the expression of survivin in leukemia cells and to investigate the effect of GMCSF on survivin expression. The survivin expressions in 37 previously untreated leukemia patients and 10 normal persons as well as in three kinds of leukemia cell lines (K562, HL60, U937) were analyzed by RTPCR. The H

5、L60 cells were treated by the proper concentration of GMCSF, and the changes of survivin mRNA and protein expression levels were detected by using RTPCR and Western blot respectively. The results indicated that the positive rate of survivin gene in 37 leukemia patients was 67.6% (25/37) and signific

6、antly higher than that in normal control (20.0%). The expression level was higher in ALL cells than that in AML cells (73.3% vs 63.6%). Moreover, three kinds of leukemia cell lines all expressed survivin. After treating with the proper concentration of GMCSF for 2 days, the expression of survivin ob

7、viously increased and the expression level of survivin mRNA was upregulated by 26%, the expression level of survivin protein was upregulated by 49%. It is concluded that the survivin gene extensively express in leukemia and its cell lines, and its expression can be obviously increased by GMCSF. Key

8、words leukemia cell; survivin; GMCSF J Exp Hematol 2007; 15(1):6-9 存活蛋白(survivin)作為細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的新成員，由于其在人類正常組織不表達(dá)或低表達(dá)，而在人類多種腫瘤組織中高表達(dá)的特性1，有望成為腫瘤治療的選擇性靶點(diǎn)，引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。現(xiàn)已有研究表明，survivin表達(dá)于如結(jié)腸癌、肺癌、非霍奇金淋巴瘤等多種人類腫瘤中，且與預(yù)后相關(guān)2-4。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colonystimul

9、ating factor, GMCSF)是一種重要的造血生長(zhǎng)因子，臨床上已廣泛用于防治各種原因所致的骨髓損傷和骨髓抑制，但有研究表明GMCSF有抑制白血病細(xì)胞凋亡的作用，其具體機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們采用RTPCR的方法檢測(cè)了16例白血病的患者和3種細(xì)胞系（K562、HL60和U937）中survivin的表達(dá)水平，并以HL60細(xì)胞為對(duì)象，觀察GMCSF作用后細(xì)胞中survivin表達(dá)改變的情況。 一般資料 本組患者37例均系我院的初治白血病患者，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、骨髓組織學(xué)和免疫表型確診，符合國(guó)內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男23例，女14例，年齡14-69歲，中位年齡42.2歲。按FAB標(biāo)準(zhǔn)， 37例

10、急性髓系白血病(AML)22例，包括M1 3例，M2 9例，M3 5例，M4 2例，M5 3例；急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)15例，包括L1 2例，L2 10例，L3 3例。正常對(duì)照組10例，其中男6例，女4例，年齡18-44歲，中位年齡33.6歲，均為健康志愿者。 標(biāo)本處理 無(wú)菌操作下取抗凝骨髓液2-3 ml，用Ficoll液分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，臺(tái)盼藍(lán)拒染率大于99%。取約5×106個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加TRIZOL(Gibco公司產(chǎn)品)1 ml混勻后， -80保存，待提取RNA。 細(xì)胞培養(yǎng) 人類白血病細(xì)胞系K562、HL60和U937均以含10%胎牛血清的RPMI 1

11、640培養(yǎng)液于37 5% CO2條件下培養(yǎng)。另取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL60細(xì)胞，按2×105/ml的濃度接種于6孔板，每孔5 ml，加入合適濃度的GMCSF(100 U/ml)，培養(yǎng)2天后收集細(xì)胞，用于后續(xù)試驗(yàn)，并以未加藥的HL60細(xì)胞為對(duì)照。 RTPCR檢測(cè) 采用RTPCR技術(shù)分別檢測(cè)白血病的原代細(xì)胞、 3種細(xì)胞系和加了GMCSF作用后HL60細(xì)胞中survivin mRNA的表達(dá)。人類survivin的PCR引物為5CTCAAGGACCACCGCATCTC3和5CCTCAATCCATGGCAGCCAG3，反應(yīng)產(chǎn)物392 bp; actin為內(nèi)參照，引物為5TGTACGTTGCTATCCA

12、GGCT3和5CTCCTTAATGTCACGCACGA3，反應(yīng)產(chǎn)物247 bp。 RTPCR采取兩步法進(jìn)行。用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR的總反應(yīng)體系為50 l，其中包括cDNA 3 l, 10×PCR緩沖液 5 l, 25 mmol/L MgCl2 10 l, 10 mmol/L dNTP 1.5 l, Taq酶2 U， survivin 上、下游引物各25 pmol, actin上、下游引物各25 pmol 。反應(yīng)條件為94預(yù)變性5分鐘，94變性30秒，58復(fù)性45秒，72延伸1分鐘，循環(huán)30次，最后72再延伸10分

13、鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察、攝相，分析結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。 Western blot分析 將預(yù)冷至4的裂解緩沖液加入到經(jīng)PBS漂洗的第1天和第3天收集的HL60細(xì)胞中，冰上作用20分鐘，12 000×g離心2分鐘后，上清液保存于20； 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，上樣，SDSPAGE分離，通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，在含5%脫脂奶粉的TTBS中37封閉90分鐘，加入一抗(兔抗人survivin多克隆抗體，稀釋度為11000，美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品)4孵育過(guò)夜，加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋度為11000，北京中山

14、生物工程公司產(chǎn)品)37作用40分鐘，化學(xué)熒光法(ECL)顯色，觀察結(jié)果。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 比較采用2檢驗(yàn)，使用SPSS 10. 0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果進(jìn)行處理。 結(jié) 果 Survivin mRNA在白血病細(xì)胞中的表達(dá) 在37例白血病患者骨髓中有25例表達(dá)survivin mRNA，陽(yáng)性率為67.6%，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)的陽(yáng)性率為73.3%，較急性髓系白血病(AML)的63.6%稍高，但前二者均高于正常對(duì)照組（20.0%）(P<0.05)(表1、圖1)。這說(shuō)明survivin在白血病患者中有較高的表達(dá)率。在3種人類白血病細(xì)胞系HL60、U937和K

15、562中也有survivin的表達(dá)(圖2)。 GMCSF對(duì)HL60細(xì)胞survivin表達(dá)的影響 HL60細(xì)胞經(jīng)100 U/ml GMCSF作用2天后， survivin的表達(dá)明顯升高，其中mRNA水平平均升高了26%(圖3)，而蛋白水平則升高了49%(圖4)。 討 論 細(xì)胞增殖和凋亡的平衡對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及組織形態(tài)至關(guān)重要，平衡的破壞能為存在基因缺陷的細(xì)胞提供了生存契機(jī)，促使基因缺陷的積累和細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展5。凋亡抑制蛋白是細(xì)胞周期終末效應(yīng)階段的重要調(diào)節(jié)因子，其家族的新成員suvivin能直接抑制caspase3和caspase7的活性，阻斷細(xì)胞的凋亡過(guò)程5。與其他I

16、AP家族成員不同的是，survivin在組織分布上具有明顯的細(xì)胞選擇性，通常只表達(dá)胚胎和發(fā)育的胎兒組織，除胸腺外不見于其他正常終末分化的成人組織，而大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)均可見survivin的表達(dá)6。 Sarela等2發(fā)現(xiàn)，在59例大腸癌中有37例患者表達(dá)survivin基因，而且這些患者的5年生存率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于表達(dá)陰性者(44.8% vs 94.4%)，而在乳腺癌和肺癌中也有類似的報(bào)道3,7。Adida等4，8用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中有60%患者表達(dá)survivin基因，而在125例AML患者中同樣有60% survivin表達(dá)陽(yáng)性。在本研究中，我們用RTPCR的方法

17、檢測(cè)了37例不同類型的初治白血病患者survivin的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，37例白血病患者骨髓中有25例表達(dá)survivin mRNA表達(dá)，陽(yáng)性率為67.6%，其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞中survivin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為73.3%，較急性髓系白血病(AML)的63.6%稍高，結(jié)果同國(guó)外學(xué)者報(bào)道一致。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在多種人類白血病細(xì)胞系中同樣存在survivin的表達(dá)。 最近，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，給與生長(zhǎng)因子刺激可以使內(nèi)皮細(xì)胞中survivin和XIAP的表達(dá)水平增高，誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，從而降低對(duì)凋亡刺激的敏感性9，10。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)給與合適濃度的GMCSF(MTT法篩

18、選，數(shù)據(jù)另文報(bào)道)刺激后， HL60細(xì)胞中survivin的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，從而證明了在白血病細(xì)胞中給與生長(zhǎng)因子刺激同樣可以引起survivin的表達(dá)增高，降低對(duì)凋亡刺激的敏感性。這很可能是白血病細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸而避免凋亡的重要機(jī)制之一，這一結(jié)果對(duì)臨床上的治療有著極其重要的意義。另外，已證實(shí)bcl2在腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用，某些刺激因子在誘導(dǎo)bcl2基因表達(dá)增高的同時(shí)能引起survivin的表達(dá)增高。由此可見，survivin和bcl2之間很可能有協(xié)同作用，共同抑制細(xì)胞的凋亡，參與腫瘤的發(fā)生。 以上的研究結(jié)果表明，survivin在白血病細(xì)胞中表達(dá)明顯升高， 它通過(guò)干擾

19、腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖平衡促進(jìn)白血病的發(fā)生發(fā)展。因而，對(duì)survivin基因的作用機(jī)制和功能的進(jìn)一步研究，將有益于更清楚的了解白血病的發(fā)生機(jī)制，并對(duì)臨床治療產(chǎn)生重要的影響。晉升網(wǎng)簡(jiǎn)介晉升網(wǎng)（）致力于成為醫(yī)務(wù)工作者晉升職稱心靈導(dǎo)師；是目前國(guó)內(nèi)收錄醫(yī)學(xué)期刊、醫(yī)學(xué)雜志最多最權(quán)威的醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)平臺(tái)；提供免費(fèi)醫(yī)學(xué)期刊在線閱讀；網(wǎng)羅和甄選海量?jī)?yōu)秀醫(yī)學(xué)論文檢索，獨(dú)立研發(fā)醫(yī)學(xué)在線資源分享庫(kù)和醫(yī)學(xué)在線模擬考試庫(kù)；整合刊類、標(biāo)題、關(guān)鍵詞檢索及全文檢索，并獨(dú)家研發(fā)刊社管理和刊社加盟系統(tǒng)、在線投稿、在線查稿、在線閱讀、遠(yuǎn)程審稿、在線下載等系統(tǒng)；聚刊社力量，建服務(wù)平臺(tái)，讓晉升網(wǎng)通過(guò)“專業(yè)”走入每一個(gè)醫(yī)務(wù)人員的身邊是我們不懈的追

20、求目標(biāo)；晉升網(wǎng)()標(biāo)準(zhǔn) 最便捷的晉升通道 最高效的學(xué)習(xí)方法 最豐富的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn) 最權(quán)威的醫(yī)學(xué)期刊 最專業(yè)的醫(yī)學(xué)服務(wù)【參考文獻(xiàn)】 1Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel antiapoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Nat Med, 1997; 3: 917-9212Sarela AI, Macadam RC, Farmery SM, et al. Expression of the antiapoptosis gene, survivin, predicts death

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