椒目油對哮喘豚鼠白細胞介素4,5及氣道反應性的影響

1、椒目油對哮喘豚鼠白細胞介素4,5及氣道反應性的影響            作者： 趙睿，戚好文，謝柏梅，李志超 【關(guān)鍵詞】  椒目油；哮喘；白細胞介素    【Abstract】 AIM: To explore the effects of Jiaomu Oil on interleukin4,5 in serum and airway hyperresponsiveness (AHR) of asthmatic model in guinea

2、pig and to provide theoretical basis for treatment of asthma using Jiaomu Oil . METHODS: This experiment included 4 groups: normal control group, asthmatic model group, dexamethasone treatment group and Jiaomu Oil treatment group, involving 10 guinea pigs in each group. Asthmatic models in guinea pi

3、gs were constructed by immunization of intraperitoneal injection with saline ovalbumin (OVA) and challenge of inspiration with nebulized OVA. A threeway cannula was inserted into the lumen of the trachea for mechanical ventilation and the intratracheal pressure (IP) was measured simultaneously for r

4、eflecting airway responsiveness. The levels of IL4,5 in serum of guinea pigs were determined using enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: The levels of IL4,5 of asthmatic model group(38.2±3.4) and (344.4±21.8) ng/L were significantly higher than those of normal control group(19

5、.8±1.2) and (77.8±26.0) ng/L(P<0.01). The levels of IL4,5 of Jiaomu Oil(22.8±3.5) and (89.2±38.7) ng/Land dexamethasone groups(22.0±1.8) and (234.6±35.1) ng/Lwere both significantly lower than those of asthmatic model group(P<0.01). The level of IL4 of Jiaomu Oil

6、group didnt have any significant difference from that of dexamethasone group(P>0.05),  While  the level of IL5 of Jiaomu Oil group was significantly lower than that of dexamethasone group(P<0.01). The airway responsiveness of asthmatic model group (0.013±0.014) g/L was significa

7、ntly higher than that of normal control group (0.168±0.186) g/L, P<0.01. Compared with that of asthmatic model group, the airway responsiveness of Jiaomu Oil (0.160±0.180)  g/L and dexamethasone group (0.144±0.154) g/L both decreased significantly (P<0.01), but they didnt&#

8、160; have any statistical significance from   that of normal control group (P>0.05). The airway responsiveness of Jiaomu Oil group didnt have any statistical significance from  that of dexamethasone group (P>0.05). CONCLUSION: Jiaomu Oil could efficiently decrease the AHR of ast

9、hmatic guinea pig. The mechanism may be that Jiaomu Oil could prevent the production of IL4,5 in asthmatic guinea pig.    【Keywords】  Jiaomu Oil; asthma; interleukin4; interleukin5; airway hyperreactivity    【摘要】目的：  探討椒目油對哮喘豚鼠模型白細胞介素4,5(IL4,5)水平及氣道高反應性(AHR)的影

10、響，為椒目油治療哮喘提供理論依據(jù). 方法：  實驗分為4組： 正常對照組、哮喘模型組、地塞米松治療組和椒目油治療組，每組各10只豚鼠. 用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)建立哮喘豚鼠模型，三通管做氣管插管進行機械通氣，測定氣道內(nèi)壓力(IP)以反映氣道反應性，ELISA法檢測豚鼠血清中IL4,5含量. 結(jié)果：  哮喘模型組豚鼠血清IL4,5含量分別為(38.2±3.4)和(344.4±21.8) ng/L顯著高于正常對照組分別為(19.8±1.2)和(77.8±26.0) ng/L(P<0.01)；椒目油組IL4,5含

11、量分別為(22.8±3.5)和(89.2±38.7) ng/L和地塞米松組IL4,5含量分別為(22.0±1.8)和(234.6±35.1) ng/L均明顯低于哮喘模型組(P<0.01)；椒目油組豚鼠IL4含量與地塞米松組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但IL5含量顯著低于地塞米松組(P<0.01). 哮喘豚鼠模型組氣道反應性(0.013±0.014 g/L)與正常對照組(0.168±0.186 g/L)比較顯著升高(P<0.01)；椒目油治療組與地塞米松治療組氣道反應性分別為(0.160±0.18

12、0)和(0.144±0.154) g/L與哮喘模型組比較均顯著降低(P<0.01)，與正常對照組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；椒目油組氣道反應性與地塞米松組相比無顯著性差異(P>0.05). 結(jié)論：  椒目油能有效降低哮喘豚鼠AHR，其機制可能是抑制哮喘豚鼠體內(nèi)IL4,5的生成.     【關(guān)鍵詞】 椒目油；哮喘；白細胞介素4；白細胞介素5；氣道高反應性     支氣管哮喘是一種變態(tài)反應性疾病，IL4,5在其發(fā)病機制中占重要地位1. 目前臨床上治療哮喘多以對癥為主. 中藥椒目治療哮喘

13、歷史悠久，療效顯著，但對其止哮平喘的作用機制還不清楚. 我們旨在通過探究椒目油對哮喘豚鼠血清IL4,5含量及氣道高反應性(Hyperresponsiveness, AHR)的影響，揭示椒目治療哮喘的作用機制，為椒目油運用于臨床提供理論依據(jù).    1材料和方法    1.1材料健康雄性豚鼠40只，體質(zhì)量(250±50) g（第四軍醫(yī)大學實驗動物中心）；椒目油(第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，批號： 20050221)；卵白蛋白(OVA, Sigma公司)；磷酸組胺(上海麗珠東風生物技術(shù)有限公司)；戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限

14、公司，批號： F20041117)；豚鼠IL4,5 ELISA試劑盒美國Repidbio(RB)公司；401AI超聲霧化器(上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；動物呼吸機DH140B(浙江醫(yī)科大學醫(yī)學儀器實驗廠)；PTM9醫(yī)用微機實控儀(二道生理儀)，RM6280多道智能生理信號記錄系統(tǒng)(第四軍醫(yī)大學病理生理學教研室).    1.2方法    1.2.1豚鼠支氣管哮喘模型的建立參照文獻1. 每日激發(fā)豚鼠1次，共7 d. 每次激發(fā)直到豚鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、腹肌緊張等哮喘癥狀時為止.    1.2.2實驗分組及處

15、理用隨機數(shù)字表法將豚鼠分為4組： 正常對照組、哮喘模型組、地塞米松治療組和椒目油治療組，每組各10只. 正常對照組用等量生理鹽水致敏和霧化激發(fā). 哮喘模型組用OVA致敏激發(fā). 地塞米松治療組致敏激發(fā)方法同哮喘模型組，但激發(fā)后立即給予5 g/L地塞米松溶液霧化吸入5 min. 椒目油組致敏方法同哮喘模型組，激發(fā)后立即給予椒目油和熟精油的混合物(按11混合)，以3 mL/kg灌胃.    1.2.3氣道反應性的測定參照文獻2，以氣道內(nèi)壓力(IP)上升至基線值的20%時所對應的磷酸組胺濃度(PC20)做為體現(xiàn)氣道反應性高低的指標.    1

16、.2.4測定IL4,5含量氣道反應性測定完畢后，從豚鼠心臟直接抽血5 mL，靜置30 min后以2000 r/min離心. 收集上層血清，運用ELISA法測定血清IL4,5的含量，具體步驟參照試劑盒說明書.    統(tǒng)計學處理：  所有數(shù)據(jù)均以x±s表示. 將原始數(shù)據(jù)輸入SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包，氣道反應性的組間比較運用KruskalWallis H法和Nemenyi法檢驗；IL4,5含量的組間比較運用SNKq（StudentNewmanKeulsq）法檢驗. 顯著性水平均為0.05.百事通     2結(jié)果

17、60;   2.1模型動物大體表現(xiàn)哮喘組豚鼠在誘喘過程中出現(xiàn)哮喘發(fā)作癥狀，不同程度地表現(xiàn)為咳嗽、呼吸急促、腹肌緊張、四肢癱軟、行動遲緩或俯臥不動. 椒目油組和地塞米松組豚鼠激發(fā)后癥狀的表現(xiàn)程度較同期哮喘組明顯減弱.    2.2病理學表現(xiàn)與正常對照組相比，哮喘模型組豚鼠肺外觀體積增大，表面略腫脹，有不規(guī)則暗紅色充血區(qū)及多處小米粒大小的紅色出血點，支氣管和肺泡腔內(nèi)黏液分泌明顯增多. 哮喘組肺組織切片(圖1B)與正常對照組(圖1A)對比顯示：支氣管壁及支氣管周圍組織有多處紅細胞聚集區(qū)，且有大量炎細胞浸潤，包括淋巴細胞、嗜酸粒細胞(EOS)、單核細胞

18、等；氣道黏膜上皮增厚，氣道變窄，嚴重者可見脫落. 上述病理表現(xiàn)證明哮喘模型建立成功. 椒目油組豚鼠肺大體表現(xiàn)：體積無明顯變化，表面充血區(qū)及出血點有明顯吸收的痕跡，面積明顯小于哮喘組，出血點數(shù)量也明顯減少；切片表現(xiàn)為小氣道及肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，支氣管和肺泡腔內(nèi)分泌物顯著減少，肺組織炎性細胞浸潤明顯減少，無氣道狹窄及氣道上皮細胞脫落等現(xiàn)象(圖1C). 地塞米松組病理表現(xiàn)(圖1D)與椒目油組相似，但炎性細胞的減少較椒目油組弱.    2.3各組間豚鼠血清IL4,5含量及AHR水平的比較哮喘組豚鼠IL4,5含量與正常對照組相比均顯著升高(P<0.01，表1)；椒目油和地

19、塞米松組IL4含量較哮喘組均顯著降低(P<0.01)，但與正常對照組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩治療組IL5含量較哮喘組均顯著降低(P<0.01)，椒目油組降低更為明顯，已接近正常對照組，然而地塞米松組的IL5下降幅度較小，其水平雖低于哮喘組，但仍高于正常對照組(P<0.01)；椒目油與地塞米松兩組之間IL4含量比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但兩組IL5含量比表1各組豚鼠IL4,5及AHR水平    3討論    AHR是哮喘的重要特征，也是臨床診斷哮喘的主要依據(jù). 氣道炎癥、氣道平滑肌細胞反

20、應性及氣道重建是哮喘發(fā)病機制的三個主要因素，其中氣道炎癥為首發(fā)因素. 與哮喘關(guān)系密切的IL4,5是多種炎癥細胞所釋放的細胞因子，在AHR的發(fā)生和發(fā)展中占有重要地位. 豚鼠肺組織病理切片的結(jié)果表明椒目油能夠減輕哮喘發(fā)展過程中引起的組織充血水腫、炎性細胞浸潤甚至出血壞死等病理改變. 椒目油的上述作用可能與其減少IL4,5合成及釋放有關(guān).    IL4是一種多功能細胞因子，主要由活化T細胞和單核細胞分泌，是Th2細胞的特征性細胞因子. 它可通過對B細胞受體的去抑制作用而活化B細胞，從而介導體液免疫應答反應3. IgE是介導I型超敏反應的重要介質(zhì)，IL4對IgG向IgE轉(zhuǎn)

21、型有促進作用4；IL4與受體結(jié)合可引發(fā)受體異源二聚化并激活信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)，誘導MHC類抗原及免疫球蛋白受體基因等表達5，從而產(chǎn)生更多的IgE. IL4還促進EOS浸潤和血管細胞黏附分子1(VCAM1)、 P選擇素等多種黏附分子的表達6. 因此IL4在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用. IL5是一種作用于EOS的血源性生長因子，主要由活化T細胞產(chǎn)生，哮喘時IL5mRNA可增加300倍. IL5可活化EOS，同時也是EOS的趨化劑，上調(diào)其黏附分子(如CD11b)的表達，促進EOS同內(nèi)皮細胞黏附，此作用可能與慢性變態(tài)反應性疾病中組織損傷有關(guān)7.  

22、0; 我們的實驗結(jié)果顯示：椒目油能顯著降低哮喘豚鼠血清中IL4,5的含量，其降低IL4含量的效果與地塞米松相仿，但降低IL5含量的效果強于地塞米松；同時椒目油能夠顯著降低哮喘豚鼠AHR，其藥效與地塞米松降低豚鼠AHR的效果相仿. 而在我們另外的實驗研究中發(fā)現(xiàn)椒目油還有抑制單核細胞及EOS的作用(資料本文未顯示)，說明椒目油具有抑制炎癥細胞和前炎性細胞因子釋放的抗炎作用，進而降低AHR，達到治療哮喘的目的.    中國特有的中西醫(yī)結(jié)合療法針對哮喘“急則治標(西醫(yī)解痙，中醫(yī)降氣)，緩則治本(補腎固本)”的方法，使哮喘患者獲得較長時間的緩解期8. 中藥椒目為蕓香科植物花

23、椒干燥成熟的種子，該藥味苦、辛、性寒，具有行水消腫之功效. 有許多關(guān)于椒目治療哮喘的報道9-10，但大多數(shù)是從臨床效果來說明，而缺乏藥理學基礎(chǔ). 我們從抑制炎性因子和降低AHR出發(fā)研究椒目油治療哮喘的機制，從而為椒目治療哮喘提供藥理學基礎(chǔ). 另外椒目油富含Ca, Mg, Fe, Zn, Sr和Mn等人體必須的礦物質(zhì)，同時還具有適用范圍廣、起效時間短、維持時間長、副作用少、來源廣泛及價格低廉等優(yōu)點，因此做為一種新型哮喘治療藥物，椒目油具備良好的開發(fā)前景.    【參考文獻】    1 劉春濤. 氣道炎癥性疾病M. 北京： 人民衛(wèi)生出版社

24、，2004:506-507.    2 王長征，郭先健，王順朝. 豚鼠哮喘模型的氣道反應性測定J. 第三軍醫(yī)大學學報，1994,16(4):277-278.    3 Rudge EU, Cutler AJ, Pritchard NR, et al. Interleukin4 reduces expression of inhibitory receptor chain is constituted by two independent binding clustersJ. J Nol Biol, 2002,315(3):399.    4  Sudowe S, Arps V, Vogel T, et al. The role of interleukin4 in the regulation of sequential i