干酪乳桿菌LC_STH_13高密度培養(yǎng)基優(yōu)化

1、干酪乳桿菌LC-STH-13高密度培養(yǎng)基優(yōu)化孫天昊,*梁金鐘(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱150076摘要:以干酪乳桿菌LC-STH-13為菌種,使用M RS 基礎培養(yǎng)基對菌種的進行活化。根據M RS 培養(yǎng)基中的不同體系,對其進行改良,獲得改良的M RS 培養(yǎng)基。改良M RS 培養(yǎng)基配方為:大豆蛋白胨9g ,牛肉粉11g ,酵母浸粉5.2g ,乳糖19g ,磷酸氫二鉀2.2g ,檸檬酸三鈉1.8g ,檸檬酸銨2.4g ,吐溫801mL ,M gSO 4·7H 2O 0.56g ,M nSO 4·4H 2O 0.25g 。使用改良M RS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體活菌數比

2、M RS 高出了1個數量級;在OD 值和菌體干質量指標上,改良M RS 是M RS 的1.2倍。Optimization of High-density Culture Medium of Lactobacillus CaseiLC-STH-13StrainSun Tianhao,*Liang Jinzhong(Food Engineering College,Harbin University of Commerce,Harbin,Heilongjiang 150076,ChinaAbstract:Lactobacillus Casei LC-STH-13strain is used,and

3、 M RS medium is used to separate and purify the strain.According to the different systems of M RS medium,improving it to get a modified M RS medium.The ingredients of the modified M RS are that soy peptone 9g,beef powder 11g,yeast extract powder 5.2g,lactose 19g,dipotassium hydrogen phosphate 2.2g,t

4、risodium citrate 1.8g,ammonium citrate 2.4g,tween 801mL,M gSO 4·7H 2O 0.56g,M nSO 4·4H 2O 0.25g.The viable count of Lactobacillus Casei with modified M RS are ten times than those with M RS.Also,between OD value and dried weight,the modified M RS medium is nearly 1.2times than the basis M

5、RS medium.Key words:Lactobacillus Casei;M RS medium;OD value;high-density culture收稿日期:2010-10-12作者簡介:孫天昊(1983-,男,黑龍江人,在讀碩士,研究方向:微生物發(fā)酵技術。*為通訊作者:梁金鐘(1957-,男,教授,研究方向:微生物。0引言干酪乳桿菌(Lactobacillus casei,屬于乳桿菌屬(Lactobacillus,呈革蘭氏陽性,不產芽抱,無鞭毛,不運動,兼性異型發(fā)酵乳糖,不液化明膠,接觸酶陰性;最適生長溫度為37;菌體長短不一,兩端方形,常成鏈,菌落粗糙,灰白色,有時呈微黃色;

6、生化反應能發(fā)酵多種糖1。干酪乳桿菌具有高效降血壓降膽固醇,并且能夠誘導產生抗菌素,促進細胞分裂,產生抗體免疫,增強人體免疫及預防癌癥和抑制腫瘤生長等作用2。人體通過正常食物攝入的途徑,獲得干酪乳桿菌對人體有益的作用,就需要滿足乳桿菌必須具有抵抗胃酸、膽汁、胰酶等的能力,才能在腸道成功黏附,最終達到效果。可以說,益生菌產品中高濃度的活性菌體細胞是發(fā)揮功效的必要條件。因此,實現(xiàn)益生菌高密度培養(yǎng),是近幾年益生菌研究領域的重要目標和方向之一3。1材料與方法(1菌種來源。干酪乳桿菌(Lactobacillus Casei LC-STH-13,哈爾濱商業(yè)大學發(fā)酵工程實驗室保藏菌種。(2試驗材料。M RS

7、培養(yǎng)基和改良M RS 培養(yǎng)基過程中使用的藥品,均為分析純。采用M RS 培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基,通過單因素試驗,對培養(yǎng)基各成分進行優(yōu)化。M RS 基礎培養(yǎng)基配方為:蛋白胨10g ,牛肉粉10g ,酵母浸粉5g ,葡萄糖20g ,無水乙酸鈉2g ,檸檬酸銨2g ,磷酸第12期(總第229期農產品加工·學刊No.122010年12月Academic Periodical of Farm Products Processing Dec.文章編號:1671-9646(201012-0042-062010年第12期氫二鉀2g,吐溫801mL,MgSO4·7H2O0.58g, M nSO

8、4·4H2O0.25g,水1000mL,調pH值至6.26.4,在121下滅菌15min4。根據培養(yǎng)基的成分可以劃分為以下5種類型。(1碳源:葡萄糖。(2氮源:蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉。(3緩沖鹽:無水乙酸鈉、檸檬酸銨、磷酸氫二鉀。(4微量元素:MgSO4·7H2O,MnSO4·4H2O。(5表面活性劑:吐溫80。根據M RS基礎培養(yǎng)基,分別對碳源,氮源,緩沖鹽和微量元素4個體系做單因素試驗,按質量分數5%的接種量接種發(fā)酵,測定菌體的OD值,以確定各個體系的最佳成分。緩沖溶液正交試驗因素與水平設計見表1,微量元素正交試驗因素與水平設計見表2。1.2.3改良MR S

9、培養(yǎng)基與MR S培養(yǎng)基對比試驗在確定了改良MRS培養(yǎng)基的配方后,將改良M RS與M RS通過OD值,對活菌數和菌體干質量指標進行對比,評價改良MRS培養(yǎng)基的改良效果。OD值:菌體培養(yǎng)24h,將菌液稀釋5倍。在波長600nm下,使用紫外分光光度計測定菌體的OD 值,每次做3個平行試驗,取平均值。活菌計數法:采用稀釋平板計數法,將菌液10倍遞增稀釋到合適的濃度后,用MRS固體培養(yǎng)基傾注平板,培養(yǎng)48h,菌落計數5。干質量法:分別配置100mL的M RS和改良M RS液體培養(yǎng)基,5%的接種量,培養(yǎng)24h。在轉速8000r/min下離心20min,棄上清液,放入80烘箱干燥至恒質量。稱質量,減去離心管

10、質量,求出菌體的干質量。2結果與討論2.1改良型M RS培養(yǎng)基成分的確定以MRS基礎培養(yǎng)基為基準,不改變其他系統(tǒng)的成分和用量,只改變碳源的成分,用果糖等糖類代替葡萄糖。接種量為5%,培養(yǎng)24h,測定菌體的OD值。碳源單因素試驗見圖1。從圖1可知,干酪乳桿菌利用糊精和蔗糖的效果不太理想,葡萄糖和果糖的利用差不多,因為二者都是單糖。但是,乳糖的OD值是最高的,雖然乳糖是雙糖,但是它可水解為葡萄糖和半乳糖,這2種單糖都是干酪乳桿菌可以利用的。因此,選擇乳糖代替葡萄糖為碳源。以MRS基礎培養(yǎng)基為基準,不改變其他系統(tǒng)的成分和用量,只改變氮源中蛋白胨的成分,以大豆蛋白胨等蛋白胨類產品代替蛋白胨。接種量為5

11、%,培養(yǎng)24h,測定菌體的OD值。氮源單因素試驗見圖2。從圖2可知,酪蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨的OD值都在1附近,干酪乳桿菌利用它們的效果基本差不多。但大豆蛋白胨的OD值接近1.2,因為大豆蛋白胨里含豐富的氨基酸和生長因子,利于干酪乳桿菌生長的成分,所以在蛋白胨這部分,用大豆蛋白胨代替蛋白胨。緩沖鹽體系中的陰離子能中和乳酸菌發(fā)酵產生的乳酸,用以調節(jié)發(fā)酵液的pH值。它的陽離子還能起到平衡滲透壓的作用。因此,分別從陽離子和陰離子兩方面,做緩沖鹽的單因素試驗。陽離子要具有鉀離水平A磷酸氫二鉀B檸檬酸三鈉C檸檬酸銨1 2 3表1緩沖溶液正交試驗因素與水平設計/g·L-1水平A MgSO4&#

12、183;7H2O B M nSO4·4H2O123表2微量元素正交試驗因素與水平設計/g·L-1圖1碳源單因素試驗果糖OD值碳源葡萄糖蔗糖麥芽糖乳糖糊精圖2氮源單因素試驗大豆蛋白胨OD值碳源酪蛋白胨胰蛋白胨蛋白胨孫天昊,等:干酪乳桿菌LC-STH-13高密度培養(yǎng)基優(yōu)化·43·農產品加工·學刊2010年第12期a 1b 1c 1O D 值a 1b 2c 1a 1b 3c 1a 2b 1c 1a 2b 2c 1a 2b 3c 1a 3b 1c 1a 3b 2c 1a 3b 3c 1MRS子、鈉離子和銨根離子;陰離子要具有磷酸根離子、檸檬酸根離子和乙

13、酸根離子。(1按陽離子分類單因素試驗。為了滿足陽離子具有鉀離子、鈉離子和銨根離子的要求,每種陽離子選1種緩沖鹽,保證體系內有3種緩沖鹽。緩沖鹽代替MRS 緩沖體系進行單因素實驗,不改變其他系統(tǒng)的成分和應用。接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。陽離子單因素試驗和各平均值見表3,緩沖溶液單因素試驗A 見圖3。由圖3可知,磷酸氫二鉀的效果比磷酸二氫鉀好,檸檬酸銨比檸檬酸氫二銨好,因為酸根離子價越高,中和酸的能力越強,可見,發(fā)酵液pH 值的升高,有利于菌體的生長。從各緩沖鹽的平均值來看,a 2b 1c 2組合(即M RS 的平均OD 值最高。但是在單因素試驗中,a 2b 3c 2的組合OD

14、 值最高,達到1.241。其原因也是檸檬酸根式負三價,而乙酸根是負一價,前者升高pH 能力比后者強,所以選擇“磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、檸檬酸銨”的緩沖體系。由檸檬酸三鈉代替無水乙酸鈉。(2按陰離子分類單因素實驗。為了滿足陰離子具有磷酸根離子、檸檬酸根離子和乙酸根離子的要求,每種陰離子選1種緩沖鹽,保證體系內有3種緩沖鹽。緩沖鹽代替MRS 緩沖體系進行單因素試驗,不改變其他系統(tǒng)的成分和應用。接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。表3陽離子單因素試驗和各平均值水平1234銨根離子檸檬酸氫二銨檸檬酸鈉平均值鉀離子磷酸二氫鉀磷酸氫二鉀平均值乙酸鈉磷酸氫二鈉檸檬酸三鈉酒石酸鉀鈉平均值圖3緩沖溶

15、液單因素試驗A陰離子單因素試驗和各平均值見表4,緩沖溶液單因素試驗B 見圖4。由圖4和表4可知,a 2b 2c 1組合OD 值無論是緩沖鹽的平均值,還是單因素試驗都是最高的,且高于對照的MRS ,所以選擇“磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、乙酸鈉”的緩沖體系。綜合上述2個試驗中,陽離子實驗最大OD 值1.241,陰離子實驗最大OD 值1.179。其原因可能就在于檸檬酸根中和酸的能力大于乙酸根。所以最后選定“磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、檸檬酸銨”的組合。表4陰離子單因素試驗和各平均值水平123c 乙酸根離子乙酸鈉a 磷酸根離子磷酸二氫鉀磷酸氫二鉀酒石酸鉀鈉平均值0.9611.1250.975b 檸檬酸根離子檸

16、檬酸氫二銨檸檬酸三鈉檸檬酸銨平均值這樣能最大限度中和乳酸,調節(jié)pH 值,提高干酪乳桿菌的生長量。分別選取硫酸亞鐵等硫酸鹽以0.058g/L 的質量濃度作培養(yǎng)基的微量元素,以1瓶不添加任何微量元素作對照組。接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。微量元素單因素試驗見圖5。1.41.21.00.80.60.40.20.0a 1b 1c 1O D 值a 1b 1c 2a 1b 2c 2a 1b 3c 1a 1b 3c 2a 1b 4c 1a 1b 4c 2a 2b 1c 1a 2b 1c 2a 2b 2c 1a 2b 2c 2a 2b 3c 1a 2b 3c 2a 2b 4c 1a 2b 4

17、c 2a 1b 2c 1·44·2010年第12期由圖5顯示,硫酸銅的OD 值很低,說明Cu 2+對干酪乳桿菌的生長起抑制作用。硫酸鎂和硫酸錳的OD 值最高,明顯高于未加任何微量元素的對照組。所以微量元素中還繼續(xù)使用M RS 中的這2種成分。經過了一系列單因素替換試驗,確定了改良M RS 的基本配方:碳源為乳糖;氮源為大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉;緩沖溶液為磷酸氫二鉀、檸檬酸三鈉、檸檬酸銨;微量元素為M gSO 4·7H 2O ,M nSO 4·4H 2O ;表面活性劑為吐溫80。2.2改良型M RS 培養(yǎng)基成分使用量的確定2.2.1碳源(乳糖使用量的確

18、定不改變培養(yǎng)基其他成分,根據M RS 中葡萄糖的質量濃度1822g/L ,測定乳糖的使用量。接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。乳糖使用量測定見圖6。(1大豆蛋白胨使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據M RS 中蛋白胨的質量濃度812g/L ,測定大豆蛋白胨的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。大豆蛋白胨使用量測定見圖7。由圖7可知,大豆蛋白胨質量濃度為9g/L 時,菌體OD 值最高,達到了1.107。增加大豆蛋白胨的濃度菌體的生長量也沒有增大,可能與培養(yǎng)基其他成分用量有關。因此大豆蛋白胨的使用量確定為9g/L 。(2酵母浸粉使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成

19、分,根據M RS 中酵母浸粉的質量濃度4.65.4g/L ,測定酵母浸粉的使用量。接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。酵母浸粉使用量測定見圖8。由圖8可知,酵母浸粉質量濃度為5.2g/L 時,菌體OD 值最高,達到1.282。故酵母浸粉的使用量確定為5.2g/L 。(3牛肉粉使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據M RS 中牛肉粉質量濃度812g/L ,測定牛肉粉的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。牛肉粉使用量測定見圖9。由圖9可知,當牛肉粉質量濃度為11g/L 時,菌體OD 值最高,達到1.156。故牛肉粉的使用量確定為11g/L 。(1磷酸氫二鉀使用量的

20、確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據MRS 中磷酸氫二鉀的質量濃度圖6乳糖使用量測定圖5微量元素單因素試驗硫酸亞鐵O D 值硫酸銅硫酸錳硫酸鋅硫酸鎂對照組1819202122O D 值乳糖質量濃度/g ·L -1圖7大豆蛋白胨使用量測定089101112O D 值大豆蛋白胨質量濃度/g ·L -1圖8酵母浸粉使用量測定O D 值酵母浸粉質量濃度/g ·L -1圖9牛肉粉使用量測定89101112O D 值牛肉粉質量濃度/g ·L -1孫天昊,等:干酪乳桿菌LC-STH-13高密度培養(yǎng)基優(yōu)化·45·農產品加工·學刊2010年第12

21、期1.62.4g/L ,測定磷酸氫二鉀的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。磷酸氫二鉀使用量測定見圖10。由圖10可知,質量濃度為2.0g/L 時,菌體OD值最高,達到1.16。之后增大了磷酸氫二鉀的用量,菌體的OD 值下降很明顯,可能是陽離子量的增多,增大了滲透眼,抑制了菌體的生長。因此磷酸氫二鉀的使用量確定為2.0g/L 。(2檸檬酸三鈉使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據MRS 中乙酸鈉的質量濃度1.62.4g/L ,測定檸檬酸三鈉的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。檸檬酸三鈉使用量測定見圖11。時,菌體OD 值最高,達到1.164。之后隨著

22、檸檬酸三鈉濃度的增大,菌體OD 值明顯下降,可能是鈉離子增大了菌液的滲透壓,抑制了菌體的生長。因此檸檬酸三鈉的使用量確定為1.8g/L 。(3檸檬酸銨使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據M RS 中檸檬酸銨的質量濃度1.62.4g/L ,測定檸檬酸銨的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。檸檬酸銨的使用量測定見圖12。(1MgSO 4·7H 2O 使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據MRS 中微量元素硫酸鎂的質量濃度0.540.62g/L ,測定硫酸鎂的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。硫酸鎂的使用量測定見圖13。由圖13顯示,硫酸鎂質

23、量濃度為0.56g/L 時,菌體OD 值最高,達到1.26。之后,隨著硫酸鎂濃度的增大,菌體OD 值顯著下降,因為微量元素的濃度增大會抑制菌體的生長。因此硫酸鎂的使用量確定為0.56g/L 。(2MnSO 4·4H 2O 使用量的確定。不改變培養(yǎng)基其他成分,根據MRS 中微量元素硫酸錳的質量濃度0.210.29g/L ,測定硫酸錳的使用量,接種量為5%,培養(yǎng)24h ,測定菌體的OD 值。硫酸錳使用量測定見圖14。由圖14顯示,硫酸錳質量濃度為0.25g/L 時,菌體OD 值最高,達到1.227。開始時,硫酸錳的濃度增大,菌體OD 值增大;達到最大值后,菌體的圖10磷酸氫二鉀使用量測定

24、O D 值磷酸氫二鉀質量濃度/g ·L -1圖11檸檬酸三鈉使用量測定O D 值檸檬酸三鈉質量濃度/g ·L -1圖12檸檬酸銨的使用量測定O D 值檸檬酸銨質量濃度/g ·L -1圖13硫酸鎂的使用量測定O D 值硫酸鎂質量濃度/g ·L -1圖14硫酸錳使用量測定O D 值硫酸錳質量濃度/g ·L -1·46·2010 年第 12 期 孫天昊，等：干酪乳桿菌 LC- STH- 13 高密度培養(yǎng)基優(yōu)化 · · 47 OD 值顯著下降，因為微量元素濃度過大會抑制菌體 的生長。因此硫酸錳的使用量確定為 0.

25、25 g/L。 2.3 改良 MRS 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗 2.3.1 緩沖溶液正交試驗 緩沖溶液正交試驗結果與分析見表 5。 表5 試驗號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 1 1 1 2 2 2 3 3 3 0.976 1.029 1.046 0.07 追加試驗結果見表 7。 表7 組號 A1B2 A2B2 追加試驗結果 活菌數 /cfu mL- 1 · 1.7×1010 3.6×1010 緩沖溶液正交試驗結果與分析 B 檸檬酸三鈉 C 檸檬酸銨 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1.02 1.038 0.994 0.044 1 2 3

26、 2 3 1 3 1 2 0.964 1.035 1.053 0.089 OD 值 0.913 1.038 0.978 1.039 1.073 0.976 1.108 1.002 1.027 A 磷酸氫二鉀 根據表 7 追加試驗結果可知，最優(yōu)組合為 A2B2。 2.4 改良 MRS 培養(yǎng)基對比試驗 通過單因素、正交試驗的一系列優(yōu)化，確定了改 良 MRS 培養(yǎng)基的組成和用量。具體配方如下：大豆 蛋 白 胨 9 g， 牛 肉 粉 11 g， 酵 母 浸 粉 5.2 g， 乳 糖 19 g，磷酸氫二鉀 2.2 g，檸檬酸三鈉 1.8 g， 檸檬酸 銨 2.4 g， 吐 溫 80 1 mL， MgSO

27、4 · 2O 0.56 g， 7H MnSO4 4H2O 0.25 g，水 1 L。 · 對比試驗結果見表 8。 表8 項目 MRS 改良 MRS OD 值 1.143 1.395 對比試驗結果 活菌數 /cfu mL- 1 · 1.17×1012 2.39×1013 菌體干質量 /g (100 mL - 1 · ） 0.998 8 1.177 2 正交試驗表明，3 種緩沖鹽中檸檬酸銨對菌體 OD 值得影響最大，影響依次是：檸檬酸銨 > 磷酸氫 二鉀 > 檸檬酸三鈉。最優(yōu)組合為 A3B2C3，由于上述 9 個試驗中并沒有此最優(yōu)組合，因此還需要追加試驗確 定最優(yōu)組合的 OD 值，最優(yōu)組合和正交試驗的最大值 A3B1C3 進行比較。最優(yōu)組合 A3B2C3 的 OD 值經測定為 1.129，大于 A3B1C3，符合試驗結果。因此，可以確 定緩沖鹽體系的最佳組合為 A3B2C3。 2.3.2 微量元素正交試驗 微量元素正交試驗結果與分析見表 6。 表6 試驗號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1