改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR快速檢測大腸桿菌O 157 H 7

1、改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR快速檢測大腸桿菌O 157 :H 7    腸出血性大腸桿菌（Enteronbsp;Hemorrhagicnbsp;E.coli）Onbsp;157nbsp;:Hnbsp;7nbsp;是近十年來認(rèn)識(shí)的一種引起人類出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagicnbsp;coli-tisnbsp;HC）和溶血性尿毒綜     賀連華 ，扈慶華 ，石曉路 ，鄭琳琳 ，李慶閣 ，張佳峰 ，莊志雄 ，劉小立 ，張順祥 ，王冰 ，吳平芳 ，劉濤 摘要:目的 建立改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR快速檢測大腸桿菌O 157 :H

2、 7 的快速方法。 方法 根據(jù)GenBank公布O 157 :H 7 的rfbE保守序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物和改良分子信標(biāo)探針，用FAM熒光劑標(biāo)記探針的5'端，建立改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR檢測O 157 :H 7 的反應(yīng)體系，應(yīng)用于食物中毒快速診斷和食品微生物檢測。 結(jié)果 共檢測11種細(xì)菌，只有大腸桿菌O 157 :H 7 有熒光信號(hào)，其余10種全無熒光信號(hào)，且與其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)，DNA靈敏度為64fg，菌液靈敏度為59cfu/ml或2cfu/PCR反應(yīng)體系。應(yīng)用改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系檢測10株O 157 :H 7 均出現(xiàn)特異的熒光信號(hào)，無干擾。對(duì)89份食品樣品進(jìn)行檢測，5份O 15

3、7 :H 7 實(shí)時(shí)PCR陽性，其余樣品為陰性，檢測僅需2h。5份陽性樣本，經(jīng)傳統(tǒng)方法培養(yǎng)，有3份檢出大腸桿菌O 157 :H 7 。 結(jié)論 改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR檢測體系快速、靈敏度高，特異性強(qiáng)，可用于大腸桿菌O 157 :H 7 食物中毒的快速診斷和食品微生物檢測，為食源性疾病的分子流行病學(xué)調(diào)查提供新的檢測手段。   關(guān)鍵詞:大腸桿菌O 157 :H 7 ;改良分子信標(biāo);實(shí)時(shí)PCR   Rapid Detection of E.coli O 157 :H 7 by using modified beacons and real-time PCR.   HE Li

4、an-hua，HUQing-hua，SHI Xiao-lu，et al.   （Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）     Abstract:Objective To establish a method for rapid detection of E.coli O 157 :H 7 from samples of contaminated food by using modified molec

5、ular beacons and real-time PCR. Methods The primers and modified molecular beacons were designed based on the core sequence of rfbE gene published on GenBank for detection of E.coli O 157 :H 7 .The probe was labeled with FAM at5'end.The molecular beacons and primer setwas tested against numerous

6、 strains from11different bacterial species and used for rapid detec-tion and diagnosis of ffod poisoning. Results For the modified molecular beacons-based real-time PCR assay，the sensitivity was64fg，59cfu/ml or2cfu/PCR reaction.There was no cross-reaction with other bacteria as control.The real-time

7、 PCR assay was used to detect10E.coli O 157 :H 7 and no false signals were observed.89food samples were tested and E.coli O 157 :H 7 was de-tected from5samples by real time PCR.3samples were positive for E.coli O 157 :H 7 detected by traditional culture method.The overall test could be finished with

8、in2hours. Conclusion The modified molecular beacons-based real-time PCR assay is rapid，sensitive and specific for detection of E.coli O 157 :H 7 from contaminated food.   Key words:E.coli O 157 :H 7 ;Modified molecular beacon;Real-time PCR        腸出血性大腸桿菌（Entero He

9、morrhagic E.coli）O 157 :H 7 是近十年來認(rèn)識(shí)的一種引起人類出血性結(jié)腸炎（Hemorrhagic coli-tis HC）和溶血性尿毒綜合怔（Hemolytic aremic syndrom HUS）的腸道致病菌 1 。由于E.O 157 :H 7 感染劑量極低，在食入不足5個(gè)細(xì)菌就可引起疾病，且病情發(fā)展快，死亡率高，近年在歐美、日本等國已多次爆發(fā)流行，對(duì)人類的健康構(gòu)成了重大的威脅 2 。我國1986年已發(fā)現(xiàn)E.O 157 :H 7 感染病人，并在安徽、江蘇等地爆發(fā)了食物中毒 3 。O 157 :H 7 也可以感染動(dòng)物，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中引起類似于出血性腸炎或溶血性尿毒綜合

10、怔等癥狀，表明是一種人畜共患病 4 。     我國目前對(duì)E.O 157 :H 7 等病原體大多數(shù)是傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測，細(xì)菌從分離、培養(yǎng)、鑒定需要1周左右的時(shí)間，耗時(shí)耗材，而且檢出率很低，顯然對(duì)E.O 157 :H 7 等惡性病原體爆發(fā)的診斷不適宜 5 。自1995年美國PE公司提出實(shí)時(shí)PCR檢測原理后，實(shí)時(shí)PCR以其快速、定量、無需后電泳、無交叉污染等突出優(yōu)點(diǎn)而被廣泛采用 6 。其原理為退火階段，分子信標(biāo)與生產(chǎn)的靶序列結(jié)合發(fā)出熒光，在延伸階段則脫離靶序列而不干擾擴(kuò)增，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，與摸板結(jié)合的分子信標(biāo)的量亦增加，最終的熒光強(qiáng)度與模板量成正相關(guān)。改良分子信標(biāo)是

11、在分子信標(biāo)的基礎(chǔ)上提出的一種新型分子探針，以它為基礎(chǔ)建立的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)可以更好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR檢測多種致病菌。本文采用改良分子信標(biāo)技術(shù)建立E.O 157 :H 7 的實(shí)時(shí)PCR方法，和國家標(biāo)準(zhǔn)方法比較，顯示新方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，并用于食物中毒快速診斷和食品致病菌篩查。與常規(guī)PCR方法相比，由于引物和探針的“雙保險(xiǎn)”，顯示特異性更強(qiáng)，并具有操作簡單、可定量、污染少等優(yōu)點(diǎn)。   1 材料與方法     1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 包括1株沙門氏菌、1株志賀氏菌、1株EPEC、1株EIEC、1株ETEC、1株O 157 :H 7 、1株金黃色葡萄球菌、1株蠟樣芽孢桿

12、菌、1株李斯特菌、1株變形桿菌、1株副溶血性弧菌，全部菌株均購自中國藥品生物制品檢定所。     1.2 模板提取 全部菌株經(jīng)LB增菌培養(yǎng)過夜后，菌體用500l TEbuffer懸浮，加入終濃度為1%SDS和0.2g/l的蛋白酶K，55作用1h后，用酚-氯仿抽提DNA?；蛉?ml菌液，離心沉淀，制備菌懸液，煮沸，取上清夜5l用于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。   1.3 引物和探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的O 157 :H 7 rfbE的序列并比較分析，自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物和探針，引物和探針均由上海Sangon公司合成，探針用FAM標(biāo)記。   &#

13、160; 1.4 PCR反應(yīng)條件 反應(yīng)總體積為25l，內(nèi)含5l模板，2.5l110PCR緩沖液，1.5mmoMgc12，0.25mmol/Ld-NTP，IUTaq酶，25pmol引物，25pmol探針。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)參數(shù)為94預(yù)變性5min，40個(gè)循環(huán)中94變性30s，52退火40s，72延伸30s。用icycle熒光PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad）檢測退火的熒光。     1.5 結(jié)果判斷 檢測樣本Ct值小于等于35.0時(shí)，測定結(jié)果有效，可直接報(bào)告樣本陽性;檢測樣本Ct值大于35.0且小于40時(shí)，重復(fù)一次，如果Ct值仍小于40，且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長期，可報(bào)告樣本

14、陽性，否則報(bào)告樣本陰性;檢測不到樣本Ct值時(shí)，報(bào)告樣本陰性。     1.6 特異性檢測 用上述11種細(xì)菌作對(duì)照，對(duì)O 157 :H 7 進(jìn)行rfbE改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。取O 157 :H 7 作為代表株，包括DNA靈敏度分析和菌液靈敏度分析。DNA靈敏度分析為按常規(guī)DNA提取方法提取模板DNA用Ultrospec2000紫外可見光核酸分析儀（Phamacia公司）測DNA的濃度。然后進(jìn)行5倍稀釋，每個(gè)稀釋度取1ul用于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。菌液靈敏度分析為O 157 :H 7 增菌后，進(jìn)行10倍稀釋，工作10個(gè)稀釋度，然后依次取10個(gè)稀釋度的1ml菌液進(jìn)行實(shí)時(shí)

15、PCR反應(yīng)。   2 結(jié)果     2.1 特異性分析 11種細(xì)菌經(jīng)改良分子信標(biāo)體系檢測，只有O 157 :H 7 有熒光信號(hào)其他細(xì)菌無熒光信號(hào)，DNA靈敏度為64fg/l，菌液靈敏度為59cfu/ml或2cfu/PCR反應(yīng)體系。     2.2 樣本檢測結(jié)果 對(duì)89份樣本以改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR快速檢測結(jié)果見表1。     表1 89份樣本以改良分子信標(biāo)實(shí)時(shí)PCR O 157 :H 7 的檢出情況（略）     對(duì)其中5份PCR法檢出O 157 :H 7 陽性的樣

16、本，用金標(biāo)法篩選，顯示均為強(qiáng)陽性;用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，檢測檢出3份。     3 討論     本文在改良分子信標(biāo)技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了實(shí)時(shí)PCR快 速檢測O 157 :H 7 的方法。結(jié)果表明此方法檢測DNA靈敏度為64fg/ul，菌液靈敏度為59cfu/ml或2cfu/PCR反應(yīng)體系，以及特異性強(qiáng)，與對(duì)照組11種細(xì)菌無交叉反應(yīng)，且操作簡單，結(jié)果觀察直觀明了，可一次檢測96份樣品，適用于O 157 :H 7 食物中毒的快速診斷和大量樣品的檢測，無交叉污染。對(duì)于大便和嘔吐物標(biāo)本，從樣品處理到檢測結(jié)果僅需2h，對(duì)食品樣本僅需1d時(shí)間。在建立單一

17、實(shí)時(shí)PCR快速檢測細(xì)菌的基礎(chǔ)上，最終實(shí)現(xiàn)多重實(shí)時(shí)PCR同時(shí)診斷10種食源性致病菌，滿足常見細(xì)菌性食物中毒快速診斷的要求。     改良分子信標(biāo)探針是為了提高雜交效率，在原來分子信標(biāo)的基礎(chǔ)上提出來的。改良分子信標(biāo)的突出特點(diǎn)是將分子信標(biāo)的臂部分也作為靶識(shí)別序列，而不僅僅是用于形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的無關(guān)添加序列。對(duì)于同樣長度的檢測靶序列，改良分子信標(biāo)比分子信標(biāo)更短，而且由于臂序列不再懸空，因而與靶序列的結(jié)合更緊密。改良分子信標(biāo)比分子信標(biāo)更易設(shè)計(jì)且成功率更高，同時(shí)對(duì)擴(kuò)增條件要求不嚴(yán)。     本文所建立的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)快速檢測方法，可用于細(xì)菌性食物中

18、毒和食品微生物的檢驗(yàn)，隨著生態(tài)環(huán)境的變化和抗生素的濫用，許多致病菌引起的臨床癥狀越來越不典型，常常需要同時(shí)檢測多種細(xì)菌才能確定病原。另外在食品微生物檢驗(yàn)中，如果只采用單一分子信標(biāo)體系檢測單一細(xì)菌，就會(huì)出現(xiàn)成本高的缺點(diǎn)。因此，又快又能同時(shí)檢測多種病原微生物的多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測多種細(xì)菌是未來發(fā)展方向。   參考文獻(xiàn):      1 Griffin PM andRV Tauxe.The epidemiology of infections caused by Es-chrichia Coli O157 :H 7 ，other enterohemorrhagic E.coli，and the associated hemolytic uremic syndromeJ.Epidemiol Rev，1991，13（1）:6098.     2Ony J，Zhe-L，Robins-Browne-R，et al.Prevalence of verocytotoxigenic Eshcherichia coli serotype O154 :H 7 in children with diarrhoea attendinga