復(fù)合bFGF緩釋微球的制備與性能測定(1)

1、    復(fù)合bFGF緩釋微球的制備與性能測定(1)    】 目的：制備復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的可降解緩釋微球，考察其各項性能，為進(jìn)一步應(yīng)用于組織工程奠定基礎(chǔ). 方法：采用改良的乳化冷凝法交聯(lián)制備復(fù)合bFGF的緩釋微球，測定微球形態(tài)、粒徑、載藥率和包裹率等，并采用ELISA法考察其體外bFGF的緩釋效能. 結(jié)果：緩釋微球平均粒徑(12.4±3.6) m；平均載藥率為0.24%，平均包裹率為96.82%. d 1體外釋放28.23%，25 d時累積釋放率達(dá)到57.19%, d 7時釋放減慢且

2、累計濃度為93.94%. 結(jié)論：復(fù)合bFGF的緩釋微球制備工藝簡便，性能優(yōu)良；可在較長時間內(nèi)持續(xù)釋放活性bFGF，與組織工程支架的結(jié)合應(yīng)用具有可行性.【關(guān)鍵詞】 堿性成纖維細(xì)胞生長因子；微球；緩釋；包裹率0引言生長因子的應(yīng)用一直是組織工程領(lǐng)域的重課題之一. 它具有多種生物學(xué)活性，可提供有利于細(xì)胞生長的微環(huán)境，促進(jìn)新生組織血管生成等1. 但由于生長因子半衰期短，溶液進(jìn)入體內(nèi)后迅速擴散、變性或酶解，難以保持其生物活性2. 我們制備復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的緩釋微球載體，并考察微球形態(tài)、粒徑、載藥率、包裹率及釋放效果等性能，

3、以期利用此種新型載體在較長時期內(nèi)持續(xù)釋放bFGF，為今后與組織工程支架的結(jié)合應(yīng)用奠定基礎(chǔ).1材料和方法明膠(等電點50，相對分子量99 000，華美生物工程公司)，人重組bFGF溶液(25 mg/L，等電點9.6，Sigma公司)，人bFGF定量EIA試劑盒（QuantiKineR, R&Dsystems），250 g/L戊二醛，丙酮，異丙醇，無水乙醚，液體石蠟，氨基乙酸為國產(chǎn)分析純，Span80(Sigma公司)為進(jìn)E1分析純，水為雙蒸水，JJ1型精確電子攪拌器儀，TGL16G高速離心機，GENESIS凍干機(Virtis公司)，BX41數(shù)碼顯微鏡（Olympus).1.2.1復(fù)合生

4、長因子微球的制備將含有10 g/L Span80的液體石蠟30 mL置于三口瓶中預(yù)熱至55，快速攪拌下滴加入同樣溫度的明膠水溶液4 mL，并調(diào)節(jié)攪拌速度至450 r/min，繼續(xù)攪拌10 min；形成油包水乳劑后迅速改冰浴，繼續(xù)攪拌10 min，使其完成固化；加入250 g/L戊二醛0.1 mL，攪拌下預(yù)固化2 h，4固化24 h，用適量丙酮、異丙醇、乙醚洗滌，揮去乙醚，真空干燥，得淡黃色粉末狀微球，將200 L的bFGF溶液滴加在20 mg的凍干明膠微球上，在室溫下保持30 min以使bFGF完全融入微球. 鈷60照射滅菌封存. 以丙酮為分散劑將空白微球樣本及含有bFGF的微球樣本置于光鏡下

5、，觀察其外形及分散度. 同時測量500個微球的直徑計算其平均粒徑. 以算術(shù)平均徑為微球的平均粒徑，計算公式為：平均粒徑=n1d1 n2d2 nndn/n1 n2 n3 nn    式中n1,n2nn為粒子數(shù)，d1,d2dn為粒徑.1.2.2微球含量及緩釋性能測定根據(jù)人bFGF定量EIA試劑盒說明書配置標(biāo)準(zhǔn)液，在492 nm處測各孔A值. 以標(biāo)準(zhǔn)品0，8，16，31，62，125，250和500 ng/L之A值作出標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合線形回歸方程. 取微球樣品20 mg,放入PBS緩沖液中，加熱至完全溶解，冷卻后再用緩沖液稀釋定容. 測出A492 nm值，然后在

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線上查處相應(yīng)bFGF含量，并由此計算出微球的載藥率以及標(biāo)準(zhǔn)率. 載藥率=（bFGF質(zhì)量/緩釋微球質(zhì)量）×100%. 包裹率=（bFGF質(zhì)量/緩釋微球中bFGF理論質(zhì)量）×100%. 取緩釋微球(2 mg)，用PBS緩沖液100 mL作為溶出介質(zhì). 藥物體外溶出儀的溫度保持在(37.0±0.5)磁力攪拌轉(zhuǎn)速100 rmin. 分別于各時間點(1，2，3，4，5，6，7 d)取樣100 L. 每次取樣后，立即補充同溫度的PBS緩沖液100 L. 按17 d順序，將稀釋10倍的樣品，分別加入微孔板7個孔中，每孔加樣50 L并同時加入樣品稀釋液各50 L. 將反應(yīng)板

7、充分混勻后置37 120 min. 用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌46次，向濾紙上印干. 每孔加入第一抗體工作液50 L,將反應(yīng)板置37 60 min. 洗板，并在每孔中加入酶標(biāo)抗體工作液100 L.將反應(yīng)板放置于37 60 min. 洗板后加入底物工作液100 L，置37暗處反應(yīng)10 min. 每孔中加入一滴終止液，混勻. 在A492 nm處測各孔值. 根據(jù)A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)bFGF含量.    2結(jié)果2.1緩釋微球的形態(tài)和粒徑空白緩釋微球呈圓球狀，形態(tài)及粒徑大小較均勻（Fig 1A）；復(fù)合有bFGF的緩釋微球經(jīng)溶漲體積變大，形態(tài)飽滿(Fig 1B).

8、 微球粒徑720 (12.4±3.6) m，占85.6%.2.2bFGF標(biāo)準(zhǔn)曲線在492 nm處測各孔A值，由此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Fig 2）并擬合線性回歸方程為： A=0.0042C 0.0154，r=0.9996 （P<0.001），bFGF在0500 ng/L范圍內(nèi)符合線性關(guān)系.2.3緩釋微球中bFGF的含量在492 nm處測定得A值，根據(jù)回歸方程計算出相應(yīng)bFGF含量. 緩釋微球中bFGF質(zhì)量為4.841 g，由此得出微球平均載藥率為0.24%，平均包裹率為96.82%（n=5）.2.4緩釋微球體外溶出度測定由緩釋微球體外釋放樣品各個時間點的A值得出的bFGF濃度，并由此繪

9、制出微球體外累積釋放量曲線（Fig 3）.A: Blank; B: bFGFimpregnated.            作者：劉銳，黃沙，金巖，吳紅，姜玲，劉濤【關(guān)鍵詞】,堿性成纖維細(xì)胞生長因子Preparation and characteristic test         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲

10、，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。3討論bFGF是一類具有較高活性的多聚肽，對多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)活性，可改變一些細(xì)胞的趨化性，誘導(dǎo)或抑制特殊蛋白質(zhì)的合成或分泌3. 但由于這種多功能細(xì)胞因子半衰期短，易失去活性,應(yīng)用效果不甚理想. 我們設(shè)計的緩釋微球可緩釋藥物、靶向輸送、保證藥物的治療作用的前提下減少給藥劑量以及降低藥物毒性等4. 通過含量測定，緩釋微球?qū)FGF的包裹率可達(dá)96.82%. 體外證實，復(fù)合bFGF緩釋微球在7 d內(nèi)對上皮細(xì)胞仍有促進(jìn)增殖活性5. bFGF的累積釋放量呈緩慢上升趨勢， d 1累積釋放率為28.23%

11、，不存在初始階段的“突釋”現(xiàn)象6；25 d，累積釋放量率57.19%,克服了部分同類產(chǎn)品釋放藥物時初期濃度過大，短期內(nèi)又迅速降低現(xiàn)象;到7 d時，累積釋放率達(dá)到93.94%，雖然釋放速率減慢，但體外仍有bFGF生物活性.本實驗對緩釋載體的研制尚處于實驗室階段，但由于此種緩釋微球性能優(yōu)良，可以根據(jù)組織工程化產(chǎn)品應(yīng)用的不同需，生產(chǎn)出包裹其他藥物的緩釋微球，也可同時包裹幾種生長因子發(fā)揮聯(lián)合調(diào)控的作用. 本設(shè)計工藝簡便，能較長時間持續(xù)釋放活性生長因子，在組織工程研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.【參考文獻(xiàn)】1 Richardson TP，Peters MCPolymeric system for dual

12、growth factor deliveryJNat Biotechnol, 2001;19(9)：1029-1034.2 Kawai K，Suzuki S，Tabata Y，et al. Accelerated tissue regeneration through incorporation of basic fibroblast growth factorimpregnated gelatin microspheres into artificial dermis J. Biomaterial，2000;21：489-499.3 Kinsella L，Chen HL，Smith JA，e

13、t alInteractions of putative heparinbinding domains of basic fibroblast growth factor and its receptor，F(xiàn)GFR1，with heparin using synthetic peptidesJGlycoconj J，1998；15：419-4224 Maysinger D， Krieglstein K， Filipovic J，et al Microencapsulated ciliary neurotrophic factor：Physical properties and biological activitiesJ Exp Neurol， 1996；138：177-l885 黃沙，金巖, 吳紅. 制備復(fù)合生長因子的緩釋微球并考察其對細(xì)胞的影響J. 上海生物醫(yī)學(xué)工程,2004；25（4）：22-25.Huang S, Jin Y, Wu H. Preparation and cell effect test of bFGFimpregnanted m