葉酸偶聯(lián)5氟尿嘧啶殼聚糖納米粒的制備及其體外性質(zhì)研究

1、葉酸偶聯(lián)5氟尿嘧啶殼聚糖納米粒的制備及其體外性質(zhì)研究                        【摘要】  目的 研究葉酸偶聯(lián)殼聚糖載5氟尿嘧啶納米粒的制備方法及體外性質(zhì)。方法 根據(jù)葉酸與殼聚糖的偶聯(lián)比選擇最佳工藝條件,通過葉酸活性酯與殼聚糖上的氨基反應(yīng),制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖,再通過離子交聯(lián)法制備葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒包合5氟尿嘧啶,從而制成載藥納

2、米粒。結(jié)果 制備了葉酸殼聚糖偶聯(lián)物,并包合5氟尿嘧啶成納米粒,載藥量為10.4%，包封率為50.5%，8 h累積釋藥量達(dá)35.9%。結(jié)論 優(yōu)化了葉酸偶聯(lián)5氟尿嘧啶殼聚糖納米粒的制備工藝。 【關(guān)鍵詞】  葉酸;納米粒;5氟尿嘧啶;殼聚糖    Abstract:Objective To prepare folateconjugated 5fluorouracilchitosan nanoparticles (5FUCSNPfolate) and evaluate its property in vitro. Methods The optimal tech

3、nological conditions were selected according to the conjugated ratio of folate and chitosan. Folateconjugated chitosan was prepared by the reaction of the activated folate ester with the amine group of chitosan. Folateconjugated 5fluorouracilchitosan nanoparticles were then prepared with ionic cross

4、linking. Results Folateconjugated 5fluorouracilloaded chitosan was prepared through different ways, and nanoparticles loading 5FU was prepared. The encapsulation ratio of 5FUCSNPfolate was 50.5% and the drug loading was 10.4%. The total amount of accumulated release was 35.9% at the eighth hour. Con

5、clusions The preparation condition of 5FUCSNPfolate was optimized.    Key words:folate; nanoparticles; 5fluorouracil; chitosan   5氟尿嘧啶(5fluorouracil，5FU)屬抗代謝類抗癌藥,對消化道惡性腫瘤及其他實體瘤具有良好的治療效果,但單獨使用常產(chǎn)生胃腸道毒性及骨髓抑制等毒副作用,且對肝、腎功能均有損害。近年來，通過化學(xué)修飾或?qū)?FU包裹在不同載體材料中制成納米球，以形成一種新型的藥物控釋體系來降低5FU毒副

6、作用的研究已成為研究熱點。葉酸（Folate，F(xiàn)）受體靶向就是一種近來備受青睞的新型抗腫瘤機(jī)制，它是利用葉酸受體在某些腫瘤部位的過度表達(dá)而在正常組織低水平表達(dá)的特性而實現(xiàn)葉酸偶聯(lián)藥物的靶向輸送。而偶聯(lián)載體以大分子物質(zhì)為主有利于延長體內(nèi)保留時間，提高療效。殼聚糖是一種價廉易得、便于修飾、無毒、生物相容性好,并兼有一定抗腫瘤活性的生物大分子,廣泛用于藥物治療載體。此外,近來被廣泛應(yīng)用到制藥工藝中的納米技術(shù)可進(jìn)一步提高藥物的穩(wěn)定性，并實現(xiàn)緩釋和控釋給藥。本課題選擇殼聚糖(chitosan，CS)為抗腫瘤藥物給藥系統(tǒng)的載體材料，通過葉酸活性酯與殼聚糖上的氨基反應(yīng),制得葉酸偶聯(lián)的殼聚糖，并以5FU為抗腫

7、瘤模型藥物,通過離子交聯(lián)法制得葉酸偶聯(lián)的載5FU殼聚糖納米粒。    1  材料與儀器    1.1  材料    殼聚糖 (CS,山東奧康有限公司,脫乙酰度為95.8%)，多聚磷酸鈉(TPP,天津市福晨化學(xué)試劑)，SephadexG25葡聚糖凝膠(pharmacia)，5氟尿嘧啶（5FU，南通精華制藥有限公司）,葉酸(上海新量化工試劑有限公司), 無水二甲基亞砜(DMSO)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N羥基琥珀酰亞胺(NHS)等試劑均為國產(chǎn)分析純 。  

8、0; 1.2  儀器    SHZ82恒溫震蕩器（金壇市富華儀器有限公司），TU1700紫外可見分光光度計（蘇州島津儀器有限公司），H600透射電鏡（HITACHI），1000HSA激光粒度分布儀（英國馬爾文公司）。    2  葉酸偶聯(lián)殼聚糖(FCS)的制備和純化    2.1  葉酸活性酯的制備    稱取葉酸300 mg(0.67 mmoL),溶于無水DMSO 10 mL中,再加入DCC 93 mg(0.45  mmoL)和NHS

9、 77 mg(0.67 mmoL)及三乙胺500 L,反應(yīng)過夜,過濾除去反應(yīng)副產(chǎn)物二環(huán)己基脲（DCU）,減壓蒸餾除去部分溶劑,在攪拌中逐滴滴入冰冷的含30%丙酮的無水乙醚溶液中,得到黃色沉淀物,過濾,真空干燥,得到葉酸活性酯1。    2.2  葉酸偶聯(lián)殼聚糖的制備    稱取20 mg殼聚糖（分子質(zhì)量5 kD）,懸浮于5 mL無水DMSO中,磁力攪拌下逐滴滴入葉酸活性酯DMSO溶液2 mL,在適當(dāng)溫度（50 ）下反應(yīng)2 h,過濾，濾渣用蒸餾水洗滌數(shù)次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%醋酸溶液10 mL溶解,低速離心后取其上清液,用Sepha

10、dexG25葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離,收集，冷凍干燥后備用。    2.3  葉酸偶聯(lián)殼聚糖的純化    231  葉酸偶聯(lián)殼聚糖的純化  選用SephadexG25葡聚糖凝膠柱進(jìn)行分離,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的醋酸溶液為流動相進(jìn)行洗脫,流速為1.5 mL/min，在葉酸波長為363 nm處監(jiān)測洗脫過程，葉酸偶聯(lián)殼聚糖的洗脫曲線見圖1。 由圖1可見,第一個峰對應(yīng)的是分子量大的葉酸偶聯(lián)殼聚糖,第二個峰對應(yīng)的是分子量較小的游離葉酸,表明2者通過凝膠柱的分子篩效應(yīng)得到了完全的分離。氟尿嘧啶殼聚糖納米粒的制備及其體外性質(zhì)研究

11、    2.3.3   葉酸偶聯(lián)殼聚糖制備工藝優(yōu)化    2.3.3.1  葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備  精密稱取葉酸11.5 mg,置100 mL容量瓶中,用醋酸醋酸鈉緩沖液(pH=5.8)溶解并稀釋至刻度,分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中,用醋酸醋酸鈉緩沖液稀釋至刻度,以醋酸醋酸鈉緩沖液為空白,用紫外分光光度計在363 nm 處測定吸光度,以葉酸質(zhì)量濃度對吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程A=0.0142+0.0034(r=0.999 8)，表明葉酸的質(zhì)量濃度

12、在5.7534.5 g/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。    2332  偶聯(lián)比的計算  精密稱取少許純化后葉酸偶聯(lián)殼聚糖的凍干粉,溶解于2%醋酸中,用2%醋酸定容至10 mL,然后在363 nm處測定紫外吸光度,計算每毫克葉酸偶聯(lián)殼聚糖中葉酸的含量。                         &#

13、160;       偶聯(lián)比=被偶聯(lián)的葉酸的量（mg）被偶聯(lián)的殼聚糖的量（mg）=M葉酸×N葉酸M殼聚糖×N殼聚糖    2333  正交試驗  采用L9（34）正交試驗表，以偶聯(lián)比為指標(biāo)，考察葉酸殼聚糖的質(zhì)量比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度3個因素。因素水平表及試驗結(jié)果見表1-表3。  表1  因素水平表表2  L9（34）正交設(shè)計表表3  方差分析表 從上表可知,各因素對偶聯(lián)比的影響程度為A>B>C,反應(yīng)的最佳

14、工藝條件為A3B3C1,即葉酸與殼聚糖用量比為21,反應(yīng)溫度50 ,反應(yīng)時間2 h。    按最佳工藝制備葉酸偶聯(lián)物,所得的葉酸偶聯(lián)殼聚糖的偶聯(lián)比為0.160，即每個殼聚糖分子上大約偶聯(lián)18個葉酸分子。根據(jù)文獻(xiàn)報道3,在葉酸殼聚糖偶聯(lián)物上平均一個殼聚糖分子上偶聯(lián)3個葉酸分子已有較強(qiáng)的靶向性,所以筆者認(rèn)為已達(dá)到實驗?zāi)康摹?#160;   3  載5FU的葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒制備    將適量的5FU溶于NaOH溶液，往高速攪拌的葉酸偶聯(lián)的殼聚糖醋酸溶液中逐滴滴加，調(diào)節(jié)pH至5.0，然后往攪拌的溶液中滴加一定

15、濃度的TPP溶液，攪拌10 min，即得載藥納米粒。取一定量的5FU葉酸偶聯(lián)殼聚糖納米粒于吐溫水溶液中超聲分散后，在透射電鏡下拍照（圖3、圖4）。結(jié)果表明所得納米粒形態(tài)圓整，大小均一，粒徑在200 nm以內(nèi)，表面較光滑，基本為類球形的實體粒子，空白納米粒粘連不嚴(yán)重，載藥后粘連較嚴(yán)重。粒徑分布情況見圖5。    4  載藥量、包封率和累計釋放度的測定    4.1  5FU標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備    精密稱取5FU 20 mg，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并配成系列濃度，于265 nm波長

16、處測定吸光度，以質(zhì)量濃度（）對吸光度（A）作線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0527+0.0206(r=0.999 9),表明5FU的質(zhì)量濃度在20120 g/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。    4.2  載藥量和包封率的測定    將制備的載藥納米粒動態(tài)透析72 h,期間換透析介質(zhì)水3次，除去黏附未包裹的5FU,透析后冷凍干燥。精密稱取純化后葉酸偶聯(lián)殼聚糖載藥納米球約50 mg,置于100 mL燒瓶中,加0.1 mol/L鹽酸溶液50 mL,60 水浴回流3 h使納米球完全溶解,放冷,定容,過濾,取濾液

17、1 mL稀釋至10 mL,于265 nm處測定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算游離5FU的量，并計算包封率和載藥量。結(jié)果測得包封率為50.5%，載藥量為10.4%。    4.3  載藥納米粒體外釋放的測定    精密稱取凍干后的載藥納米粒60.0  mg，置預(yù)先處理好的透析袋中，加入50 mL磷酸緩沖液(PBS,pH7.4),扎緊透析袋兩端,懸浮于100.0 mL具塞錐形瓶中,錐形瓶中加入45.0 mL的磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)，將其置水浴振蕩器中（溫度37 ，振蕩頻率為100次/min）。于不同時間點取透析袋外P

18、BS 5.0  mL，在265 nm處測定吸光度,同時補(bǔ)入5.0 mL等量的新鮮釋放介質(zhì)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算其濃度和累積釋放量，取3次實驗的平均值,以累積釋藥百分率對時間作圖,繪制載藥納米粒的釋放曲線。5FU在各時間點的累積釋放百分率(Q)計算公式為：Q()=(V0×Ct+V× t-1n=1C)×100 ·m-1·X-1，式中Ct為各時間點測得釋放介質(zhì)中的5FU濃度(mg·mL-1),m-1為投入的5FU納米粒的質(zhì)量),V0為釋放介質(zhì)的總體積,V為每次取樣體積,X-1為測得5FU納米粒的載藥量()。  

19、;  5  討 論     51  針對殼聚糖水溶性差的特性，采用了先偶聯(lián)葉酸，后制備納米粒的方法，首次成功制備了葉酸偶聯(lián)殼聚糖載藥納米粒，并進(jìn)行了優(yōu)化工藝的研究。殼聚糖易溶于稀酸溶液中,但在酸性條件下發(fā)生降解,所以選用弱酸型刺激性小的醋酸。利用無毒副作用的三聚磷酸鈉（TPP）對葉酸偶聯(lián)殼聚糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化，可在一定條件下方便地制備出基于葉酸偶聯(lián)殼聚糖的納米給藥載體。在室溫、攪拌情況下，通過帶負(fù)電的磷酸根離子與殼聚糖分子鏈上帶正電的質(zhì)子化氨基發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián)凝膠化，便可迅速生成納米粒子。為了獲得高產(chǎn)率、穩(wěn)定且堅固的納米結(jié)構(gòu)微粒，葉酸偶聯(lián)殼聚糖與TPP的質(zhì)量比一般控制在31到61之間。本文選擇葉酸偶聯(lián)殼聚糖與TPP的質(zhì)量比為6，體積比為3，短時間攪拌后即生成具白色乳光的納米?；鞈乙?。由于殼聚糖的醋酸水溶液,特別是高濃度的醋酸水溶液比較黏稠,而且H+ 與2位NH2 結(jié)合酸度下降,5FU不易溶解,成粉狀混在其中，所以先用NaOH溶液溶解5FU，從一定程度上解決載藥后粘連較嚴(yán)重的問題。    52  從葉酸偶聯(lián)5FU殼聚糖納米