姜黃素調(diào)節(jié)B淋巴瘤細(xì)胞p300和HDAC1的研究

1、姜黃素調(diào)節(jié)B淋巴瘤細(xì)胞p300和HDAC1的研究(1)        作者：吳青，陳燕，李新剛，唐元艷【摘要】 p300是一種具有組蛋白乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄輔助因子，HDAC1是一種組蛋白去乙酰化酶。本研究查明姜黃素對(duì)B-NHL細(xì)胞株Raji細(xì)胞增殖的影響，并探討這種影響與p300以及HDAC1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)表達(dá)的關(guān)系。 以不同濃度(6.25-50 mol/L)的姜黃素作用于體外培養(yǎng)的Raji細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，Annexin-V-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率和應(yīng)用RT-PCR 和Weste

2、rn blot法檢測(cè)Raji細(xì)胞中HDAC1和p300的mRNA表達(dá)和蛋白含量的變化。結(jié)果表明： 姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞抑制作用呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。24小時(shí)的IC50為25 mo/L；姜黃素能夠誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，凋亡率為14.38%-61.18%，并呈濃度依賴性。姜黃素明顯抑制HDAC1和p300的活性和表達(dá)。在IC50濃度時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其p300和HDAC1 mRNA表達(dá)和蛋白含量逐漸降低，呈時(shí)間依賴性，與對(duì)照組相比有顯著性(P<0.05)。結(jié)論： 姜黃素對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞具有抗腫瘤細(xì)胞的增殖作用，并促進(jìn)其凋亡。姜黃素能夠抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子p300及組蛋白去乙

3、?；窰DAC1活性和表達(dá)，可能是其作用機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 B淋巴瘤Regulatory Effect of Curcumin on p300 and HDAC1 in B-NHL CellsAbstract The purpose of this study was to investigate the effect of curcumin on proliferation of B-NHL Raji cell line and explore the relationship between this effect and regulatory expression of p300 a

4、nd HDAC1 transcription.The in vitro cultured Raji cells were treated with curcumin at various concentrations (6.25-50 mol/L) and at different time points (0，6，12，24 and 48 hours)，the inhibitory ratio of cell growth was measured by MTT assay，the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry with

5、 Annexin V-FITC/PI double staining，the changes of p300 and HDAC1 mRNA expression and protein level in Raji cells were determined by RT-PCR and Western blot.The results showed that the curcumin could inhibit Raji cell proliferation in significant time-and concentration-dependent manners，IC50 at 24 ho

6、urs was 25 mol/L; the curcumin could induce apoptosis of Raji cells in concentration-dependent manner，apoptosis rate was 14.38%-61.18%.The curcumin significantly inhibited activity and expression of p300 and HDAC1.At IC50 concentration，expression of p300 and HDAC1 mRNA and protein level decreased wi

7、th time-dependent manner，difference between tested and control groups was significant (P<0.05). It is concluded that the curcumin can inhibit proliferation of B-NHL Raji cells and promote apoptosis of those cells.Curcumin can inhibit the activity and expression of the transcriptional co-activator

8、 p300 and HDAC1，which may be involved in its pharmacological mechanisms on B lymphoma cells.Key words curcumin; B-NHL; Raji cell; p300; HDAC1    姜黃素(curcumin，Cur)是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，其藥理作用特性有抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈硬化、抗病毒等。體外研究表明，姜黃素抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡是通過(guò)多條通路和調(diào)節(jié)多種腫瘤表面標(biāo)記因子實(shí)現(xiàn)的，而且其作用靶點(diǎn)可以從DNA、mRNA到蛋白質(zhì)水平1。

9、60;   p300是一種重要的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，它能乙酰化核心組蛋白N末端的賴氨酸殘基使核小體組蛋白與DNA的結(jié)合穩(wěn)定性下降，進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄機(jī)器與染色體的結(jié)合成為可能2。在細(xì)胞中可與多種基因轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)合而形成輔化因子復(fù)合體。除乙?；饔猛?，p300還可以在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的形成中起支架或橋梁的作用2。目前研究表明，在多種腫瘤中p300可發(fā)生多種形式的基因突變，提示p300具有促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的作用3。    組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)在真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，調(diào)節(jié)核內(nèi)蛋白質(zhì)的乙?；?/p>

10、平與基因轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HAT/HDAC活性紊亂會(huì)使基因表達(dá)失控，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生4。    本研究查明姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞組蛋白去乙酰化酶HDAC1的作用，觀察轉(zhuǎn)錄共激活因子p300的表達(dá)情況，探討姜黃素抗腫瘤的分子機(jī)制。材料和方法材料藥物 姜黃素，購(gòu)自Sigma公司，純度>99%，溶解于二甲亞砜（DMSO），分裝備用。細(xì)胞系 B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞購(gòu)自上?？茖W(xué)院細(xì)胞中心。在含有10%的胎牛血清、青霉素100 U/ml及鏈霉素100 U/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液中37、5% CO2條件下培養(yǎng)。每48小時(shí)換液傳代1次。取生長(zhǎng)良

11、好、細(xì)胞活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco產(chǎn)品)，胎牛血清(中山凌飛公司產(chǎn)品)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，Sigma產(chǎn)品) 組蛋白去乙?；窰DAC1抗體，p300抗體均購(gòu)自Santa Cruze公司，其中HDAC1為鼠抗人單克隆抗體，p300為兔抗人多克隆抗體，羊抗鼠及兔抗鼠二抗和Bio-Rad蛋白定量試劑盒、TRIzoL均購(gòu)自晶美公司。方法細(xì)胞培養(yǎng) 將Raji細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37、飽和濕度下培養(yǎng)，每2天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別用不同濃度的姜黃素處理細(xì)胞，未加藥組為對(duì)

12、照組。根據(jù)MTT法測(cè)得的姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞作用的IC50為25 mol/L，并用IC50濃度的姜黃素作用0、6、12、24及48小時(shí)，檢測(cè)HDAC1和p300蛋白及mRNA的變化。細(xì)胞體外生長(zhǎng)活性檢測(cè) 采用溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)比色法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將不同濃度的姜黃素6.25-50 mol/L加入10% FCS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于96孔板，每種藥物濃度為一組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，置5% CO2、37培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間(0、6、12、24及48小時(shí))后，每孔加MTT 20 l，培養(yǎng)4小時(shí)，棄MTT，每

13、孔加二甲亞砜150 l，充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔A值。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 用Annexin-V-FITC及PI雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組。分別加入終濃度為6.25-25 mol/L的姜黃素作用于24小時(shí)，用70%乙醇4固定24小時(shí)，PBS緩沖液洗去固定液，離心去上

14、清。用緩沖液37孵育60分鐘，195 l細(xì)胞懸液加5 l Annexin-V-FITC?；靹?，室溫放置10分鐘。用緩沖液洗滌細(xì)胞1次，在190 l緩沖液重懸，然后再加10 l 20 g碘化丙錠。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。p300及HDAC1 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè) 細(xì)胞總RNA抽提及RT-PCR步驟按TrizoL (Gibco公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所提取的總RNA溶解后用紫外分光光度儀測(cè)RNA純度和濃度(A260/A280>1.8)。在GenBank檢索基因cDNA序列，自行設(shè)計(jì)PCR引物，由上海生物工程公司合成。p300引物序列(上游引物: 5-GGGCTCAACCGACAA GAC

15、-3，下游引物: 5-GGAGGCAGAGGCAATCAA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為259 bp。-actin引物序列上游引物:5-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3；下游引物: 5-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為312 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94 30秒，94 變性1分鐘，57復(fù)性 30秒，72 50秒，72延伸10分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。HDAC1引物序列(上游引物: 5-AGTGCGGTGGTCTTACA GTG-3，下游引物: 5-TCTCCCTCCTCTTCAGAATCG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為500 bp。-actin上游引物:5-TGAGACCTTCAACAC

16、CCCAG3-；下游引物: 5-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為316 bp。PCR擴(kuò)增條件為：94 5分鐘，94 變性1分鐘，50復(fù)性 1分鐘，72 延伸1分鐘，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖膠，進(jìn)行檢測(cè)。用數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng)（Kodak EDAS290）作條帶密度掃描，結(jié)果以目的條帶與對(duì)應(yīng)的-actin密度值表示。    細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品制備及蛋白定量 經(jīng)處理后的細(xì)胞立即棄去培養(yǎng)液，洗滌，離心。加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris HCl，pH 7.6，0.001 mol/L

17、EDTA，100 g/ml PMSF，2 g/ml leupeptin) 0.1 ml，裂解30分鐘，然后10 000×g離心10分鐘，取上清備用。以上所有操作均在4下進(jìn)行。測(cè)定蛋白，并調(diào)各組蛋白濃度一致。Western blot檢測(cè) 按文獻(xiàn)5報(bào)道的Western blot方法檢測(cè)p300，HDAC1其中一抗為鼠抗，二抗用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法，X線曝光顯影，軟件進(jìn)行掃描定量，每個(gè)濃度組重復(fù)3次，取均值代表測(cè)定結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Excel 2000軟件作方差分析和t檢驗(yàn)。結(jié)果Raji細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定姜黃素以時(shí)間劑量依賴性方式抑制Raji細(xì)胞增殖，

18、6、12、24和48小時(shí)后，細(xì)胞抑制率分別如下：6.25 mol/L時(shí)為(1.25±0.7)%、(6.79±0.9)%、(18.25±1.0)%、(23.15±1.9)%；12.5 mol/L時(shí)為(4.28±0.6)%、(15.24±1.4)%、(30.25±2.0)%、(40.12±1.0)%；25 mol/L時(shí)為(10.25±1.1)%、(29.14±2.3)%、(51.25±2.8)%、(63.58±2.9)%；50 mol/L時(shí)為(17.25±2.0)%、(

19、45.78±2.7)%、（63.58±3.5)%、(78.63±3.6)%，差異有顯著性意義(P<0.01)，24小時(shí)IC50為25 mol/L(圖1)。Raji細(xì)胞凋亡率的變化細(xì)胞凋亡率隨姜黃素濃度增高而逐漸增加，兩種濃度（12.5和25 mol/L）的藥物與對(duì)照組比較均能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.05)，但 6.25 mol/L姜黃素引起的凋亡率與對(duì)照組的差異無(wú)顯著意義(P>0.05)（附表）。Table. Apoptosis ratio of Raji cells (%) inducted by various concentration

20、of curcumin at 24 hours（略）姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞p300及HDAC1 mRNA表達(dá)的影響姜黃素IC50濃度時(shí)，光密度掃描顯示第6小時(shí)的HDAC1和p300 mRNA表達(dá)已經(jīng)下降，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸降低，呈時(shí)間依賴性（圖2）。姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞p300及HDAC1蛋白表達(dá)的影響姜黃素IC50濃度處理Raji細(xì)胞6小時(shí)后p300和HDAC1蛋白表達(dá)開(kāi)始下降，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低(圖3)。討 論姜黃素(curcumin，cur) 系從中藥姜黃中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用，最近美國(guó)國(guó)立腫瘤所(NCI)將其列為第三

21、代防癌藥物，進(jìn)行臨床研究。大量資料證明，姜黃素能直接抑制腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)制主要是調(diào)控癌基因和抑癌基因6，7。此外，姜黃素還能抑制人類免疫缺陷病毒型和細(xì)胞有絲分裂的產(chǎn)生及抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-B和AP-1的活性8。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究姜黃素的抗腫瘤的機(jī)制，結(jié)果表明姜黃素能有效抑制Raji細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，且呈明顯的量效關(guān)系和時(shí)間依賴性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致9。    p300是一種具有組蛋白乙?；富钚缘霓D(zhuǎn)錄因子，對(duì)重要生物功能如細(xì)周期調(diào)控、細(xì)胞分化、凋亡等具有重要作用10。p300的一個(gè)特征是具有HAT的活性，通過(guò)募集p3

22、00相關(guān)輔助因子(PCAF)對(duì)靶組蛋白進(jìn)行乙?；喾N轉(zhuǎn)錄因子的乙?；{(diào)節(jié)都與p300有關(guān)。Xiao等11發(fā)現(xiàn)，p300是HDAC抑制劑TSA誘導(dǎo)和SP1介導(dǎo)的P21WAF1轉(zhuǎn)錄所必需的，p300共轉(zhuǎn)染可升高P21WAF1啟動(dòng)子活化，而且可以導(dǎo)致P21WAF1相關(guān)蛋白H3和H4高乙?；?。研究表明，在急性白血病、乳腺癌、肝癌和直腸癌中p300可發(fā)生多種形式的基因變異3。姜黃素作為一種新型、低效的抗癌藥物，作用于生物體細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的p300的表達(dá)水平如何變化？本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素 IC50濃度以時(shí)間依賴作用抑制Raji細(xì)胞p300的表達(dá)，最早在12小時(shí)時(shí)即顯示對(duì)p300的抑制作用，48小時(shí)時(shí)抑

23、制水平最高。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，p300 mRNA和蛋白水平顯著下降，提示姜黃素可能是通過(guò)下調(diào)p300 mRNA的表達(dá)及阻斷其蛋白產(chǎn)物抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡細(xì)胞，其發(fā)生的機(jī)制可能是通過(guò)阻斷p300的轉(zhuǎn)錄激活，降低誘導(dǎo)基因表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。    組蛋白乙酰化/去乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵機(jī)制之一。真核細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；?histone acetylase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC1)活性的平衡調(diào)控核小體核心組蛋白的乙?；郊跋嚓P(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性。HAT/ HDAC1活性紊亂則會(huì)

24、使基因表達(dá)失控，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。白血病細(xì)胞中由于染色體異位募集HDAC，導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)慕M蛋白去乙?；够虮磉_(dá)受抑和白血病發(fā)生12。有研究表明，急性白血病細(xì)胞染色體移位產(chǎn)生融合基因PML-RAR和AML-ETO，兩者編碼產(chǎn)生的融合蛋白可以募集HDAC，抑制分化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，細(xì)胞分化成熟受阻，導(dǎo)致惡性增殖。維甲酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化時(shí)，可以使HDAC1從被募集位點(diǎn)解離，沉默基因得以表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化。抑制HDAC活性，也抑制了組蛋白的去乙?；饔茫诵◇w組蛋白乙酰化水平升高，染色體結(jié)構(gòu)松弛有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，基因表達(dá)增強(qiáng)13。有研究表明，HDAC1可通過(guò)抑制hT

25、ERT mRNA的表達(dá)來(lái)下調(diào)端粒酶的活性，而端粒酶的活性與腫瘤細(xì)胞的永生化密切相關(guān)，進(jìn)而證明HDAC1在腫瘤細(xì)胞中存在高表達(dá)14。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素IC50濃度作用Raji細(xì)胞12小時(shí)可見(jiàn)HDAC1 mRNA及蛋白水平降低，而且持續(xù)48小時(shí)以上，說(shuō)明組蛋白的去乙?；玫阶柚?，可能是組蛋白乙?；街苯佑绊懩[瘤的進(jìn)程，而姜黃素可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯和分化，進(jìn)而證明了組蛋白去乙?；谀[瘤發(fā)生預(yù)防中的作用。這提示姜黃素抑制HDAC1的表達(dá)可能導(dǎo)致體內(nèi)許多細(xì)胞增殖關(guān)鍵性基因轉(zhuǎn)錄降低。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不要用于商業(yè)用途或

26、者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。    本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠抑制p300及HDAC1的表達(dá)，而且呈時(shí)間依賴性，說(shuō)明姜黃素是通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡的。因此，我們認(rèn)為姜黃素可以通過(guò)抑制p300及HDAC1活性，誘導(dǎo)組蛋白高乙?；?，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)，是一種新型抗腫瘤治療的新的分子靶向藥物?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 吳青，陳燕，李新剛.姜黃素影響caspase 8和caspase 9誘導(dǎo)淋巴瘤Raji細(xì)胞凋亡的研究.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2005； 13：624-6272 Chan HM，L

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