VP22融合型顯性負性突變體抑制乙肝病毒復制

1、VP22融合型顯性負性突變體抑制乙肝病毒復制                 作者：易軍，宮衛(wèi)東，王嶺，凌瑞，陳江浩，王輝，王廷 【關鍵詞】  肝炎病毒Inhibition of hepatitis B  virus replication by dominant negative mutant of VP22 fusion protein【Abstract】 AIM:  To investiga

2、te the inhibitory effect on hepatitis B virus (HBV) replication with dominant negative (DN) mutant of VP22 fusion protein. METHODS: Fulllength or fractions of VP22 were fused to C terminal of HBV core protein (HBc), and cloned into pcDNA3.1(-) vector, yielding eukaryotic expression plasmids of DN mu

3、tant. After transfection into HepG2.2.15 cells, the expression of DN mutant was identified by immunofluorescence staining. The inhibitory effect of DN mutant on HBV replication was indexed as the concentration of HBV surface antigen (HBsAg) in the supernatant of cell culture. And MTT assay was perfo

4、rmed to detect the cytotoxicity of transgene expression to the host cells. RESULTS: DN mutant of VP22 and its fractions could be expressed in HepG2.2.15 cells, and had no toxic effect on the host cells. The DN mutant could inhibit HBV replication, and the mutant with protein transduction ability had

5、 a stronger inhibition than that without. The DN mutant of fulllength VP22 had the strongest   inhibitory effect, reducing the HBsAg concentration by 81.94%. CONCLUSION:  DN mutant of VP22 fusion protein can enhance the inhibition of HBV replication.【Keywords】hepatitis B virus; domina

6、nt negative mutant; VP22【摘要】 目的： 了解VP22融合型顯性負性(DN)突變體對抑制乙肝病毒(HBV)復制的作用. 方法： 將VP22全長及其不同區(qū)段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端，克隆入pcDNA3.1(-)構成DN突變體真核表達質粒. 轉染HepG2.2.15細胞后，免疫熒光鑒定DN突變體在細胞內的表達，并以培養(yǎng)上清HBV表面抗原(HBsAg)的濃度為指標，觀察DN突變體對HBV病毒復制的抑制效應. 同時以MTT比色法觀察轉基因的表達對宿主細胞生長狀態(tài)的影響. 結果： VP22及其不同區(qū)段構建的DN突變體可在HepG2.2.15細胞中進行表達，且對宿主細胞

7、無毒性. VP22融合型DN突變體可有效地抑制HBV的復制，具有蛋白轉導特性的DN突變體比無轉導特性的DN突變體具有更強的抗病毒能力. 其中VP22全長構成的DN突變體具有最強的抑制效應，可使上清HBsAg濃度下降81.94%.  結論： VP22融合型DN突變體可以增強DN突變體對HBV復制的抑制. 【關鍵詞】 肝炎病毒，乙型；顯性負性突變體；VP220引言全球目前有3.5億慢性乙型肝炎病毒（hepatitis virus B, HBV）感染者，每年約有100萬人死于HBV感染的相關疾病，占疾病死因的第9位1. 目前，國際上尚無有效治療慢性乙肝的手段. 基因治療技術的不斷

8、發(fā)展為抗HBV治療提供了新的思路和途徑. 其中顯性負性(dominant negative，DN)突變體的胞內表達是HBV基因治療的重要策略之一2-6. Elliott等7發(fā)現(xiàn)，單純皰疹病毒1(herpes simplex virus type 1, HSV1)的結構蛋白VP22(及其融合蛋白)可從培養(yǎng)基進入細胞內，并可不經過細胞細胞接觸依賴性在同型或異型細胞之間轉移. 我們將HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)與VP22進行融合構成DN突變體，以期利用VP22的蛋白轉導特性進一步提高DN突變體的抗病毒效應.1材料和方法1.2.1寡核苷酸合成所有寡核苷酸的合成均由TaK

9、aRa Biotech Co. Ltd完成. 下劃線部分是為便于分子克隆操作而引入的限制性內切酶的識別序列，大寫堿基為起始碼或終止碼.  HBc1: 5gcgcggtaccATGgacatcgaccctt3 (KpnI)；HBc2:5gcgcctcgagTCAggatccacattgaggttccc3 (XhoI, BamHI)；US: 5gcccggatccatgacctctcgctccgtg3(BamHI)；UR: 5ccccagatctatcgggactcgccatacc3 (BglII)；DS: 5gccgagatctgacgcggccacggcg3 (BglII)；DR:

10、5gggcctcgagTTAcagctaatcctcttctgag3 (XhoI)；cmyc1:  5gcccggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgTAActcgaggggc3(BamHI, XhoI)；cmyc2:  5gggcctcgagTTAcagatcctcttctgagatgagtttttgttcggatccgccc3(XhoI, BamHI).1.2.2細胞培養(yǎng)HepG2.2.15細胞整合有完整的HBV基因組，能持續(xù)轉錄和翻譯HBV基因，產生HBsAg, HBeAg和Dane顆粒，由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院傳染科惠贈. 細胞在含有1

11、5 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含有終濃度為200 mg/L的G418)，37, 50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)，2 d換液1次，6 d傳代1次. 1.2.3載體構建本實驗構建的載體主要有以下幾種. pHBc： 以載體EBOHBV為模板，HBc1和HBc2為引物擴增HBc編碼序列. PCR產物經KpnI/XhoI酶切后克隆入pcDNA3.1(-)，構成載體pHBc. pHVP22/M： 將合成的cmyc1和cmyc2均調至濃度為0.1 mmol/L，取等體積混勻，于100煮沸5 min并緩慢冷卻至室溫退火形成雙鏈. 雙鏈cmyc片段經BamHI/XhoI酶切后連入經相同酶

12、切的pHBc質粒，形成pHVP22/M. pHVP22/F： 質粒pVP22/mycHis2為模板，US/DR為引物擴增VP22編碼序列全長及cmyc表位. PCR產物經BamHI/XhoI酶切后連入經相同酶切的pHBc質粒，形成pHVP22/F. pHVP22/U： BamHI單酶切質粒pHVP22/M并進行脫磷酸化處理. 以pVP22/mycHis2為模板，US/UR為引物擴增VP22編碼區(qū)上游102 bp的片段，用BamHI/BglII酶切后連入pHVP22/M的BamHI位點. 經鑒定為正向連接形成的質粒命名為pHVP22/U. pHVP22/D： 以pVP22/mycHis2為模板，

13、DS/DR為引物擴增VP22編碼區(qū)下游102 bp的片段. PCR產物經BamHI/XhoI酶切后連入經相同酶切的pHBc質粒，形成pHVP22/D. 1.2.4細胞轉染參考GIBCO公司的LipofectinMine2000轉染技術手冊，將細胞以2×108/L接種于12孔培養(yǎng)板，每孔500 L, 24 h后進行轉染. LipofectinMine 2000 5 L/孔，DNA為6 L/孔. 轉染分為7組：pHVP22/F, pHVP22/U, pHVP22/D, pHVP22/M, pHBc, pcDNA3.1(-)和空轉染組，每組設3個復孔. 1.2.5轉基因表達的檢測HepG2.2.15細胞以2×108/L接種于內置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，細胞轉染48 h后將細胞置于冰上，吸取上清于-20凍存. 用PBS (4，pH 8.0)洗滌貼壁細胞，棄去PBS，以20 g/L多聚甲醛和1 g/L Triton固定后于冰上放置30 min. PBS洗滌2次，每次5 min，加入1 mL用10 mL/L BSA/PBS 150稀釋的鼠抗HBc抗體(或cmyc抗體)，4濕盒過夜. PBS同上洗滌后加1 mL 180稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，PBS再次洗滌后以500 mL/L甘油