反義核酸對膀胱癌細胞系多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)效應

1、    反義核酸對膀胱癌細胞系多藥耐藥性 的逆轉(zhuǎn)效應        摘要：目的探討多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)的新方法。方法應用基因重組方法構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄出mdr1 mRNA反義RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，然后將該質(zhì)粒導入膀胱癌耐藥細胞系中，測定轉(zhuǎn)染細胞對不同藥物的耐藥性，觀察反義核酸對MDR的逆轉(zhuǎn)效應。結(jié)果耐藥細胞經(jīng)導入反義核酸逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒后，對阿霉素(ADM)、秋水仙素(COL)的IC50顯著降低（P0.01）；細胞膜上P-糖蛋白(P-GP)染色信號顯著減弱。結(jié)論反義核酸是逆轉(zhuǎn)膀胱

2、癌多藥耐藥性的有效方法。關(guān)鍵詞：膀胱腫瘤癌多藥耐藥性Reversal of multidrug resistance of bladder cancer cell line with antisenes RNAHE Bin（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China）（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third

3、 Military Medical University, Chongqing 400037,China）YANG Tangjun（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China）JIN Xiyu,et al.（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, C

4、hongqing 400037,China）Abstract：ObjectiveTo explore the new reversal method of multidrug resistance of bladder cancer cell line.MethodsA retroviral plasmid pLXSN-AS(+) containing the mdr1 mRNA antisense gene was cloned by inserting 1383bp fragment of mdr1 cDNA into multiple cloning sites of retrovira

5、l vector pLXSN. For evaluating the reversal efficiency of antisense RNA the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) was transfected into multidrug resistant cell lines BHA-60 with liposome.ResultsAfter the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) being transduced, the BHA-60 cell line showed significant decrease of

6、IC50 to drug (P0.01)and the P-GP positive signal.ConclusionsAntisenseis a valuable method to reverse multidrug resistance of bladder cancer cell line.Key words：Bladder neoplasmsCarcinomaMultidrug resistance為探討膀胱癌多藥耐藥性（MDR）逆轉(zhuǎn)的方法，我們構(gòu)建了能轉(zhuǎn)錄出mdr1 mRNA反義RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，然后將該質(zhì)粒導入耐藥的膀胱癌細胞系BHA-60中，觀察反義核酸對MDR的逆轉(zhuǎn)效應

7、。報告如下。材料與方法一、材料1、BIU-87 細胞：人膀胱癌移行上皮細胞系，引自北京醫(yī)科大學泌尿外科研究所。BHA-60細胞為本實驗室應用轉(zhuǎn)基因方法建立的多藥耐藥細胞系1。2、pLXSN：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在其多克隆位點上游含啟動子5- LTR，在其多克隆位點下游含SV-40啟動子和Neo基因，由美國Miller教授惠贈。質(zhì)粒pHDR5A由美國Gottesman教授2惠贈。3、主要試劑：（1）脂質(zhì)體（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取試劑盒、DNA快速連接試劑盒，購自德國Boehringer Mannheim公司。（2）G418為美國Gibercol BRL公司產(chǎn)品，用20mmo

8、l/L的HEPES稀釋成100g/l，0.2m過濾器過濾除菌，分裝后保存于-20備用。二、方法1、細胞培養(yǎng)：細胞置于37，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%新生小牛血清的RPMI-1640。2、反義核酸質(zhì)粒的構(gòu)建：用EcoR I酶切質(zhì)粒pHDR5A，獲得1 383bp長的mdr1 cDNA；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN經(jīng)EcoR I酶切后經(jīng)CIAP脫磷酸化，制備線性化載體，將mdr1 cDNA與線性化pLXSN載體連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，再用Hind 酶切鑒定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSN-AS

9、 （+）， 該質(zhì)粒能在細胞內(nèi)表達長1 383nt的mdr1 mRNA的反義RNA。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSN-AS（+）對細胞BHA-60的轉(zhuǎn)染：按說明書進行操作。選擇性培養(yǎng)基為含G418（終濃度為800g/ml）的1640培養(yǎng)基，定期更換新鮮培養(yǎng)液，共選擇培養(yǎng)1416天，長出肉眼可見克隆，該細胞系命名為BHA-AS。同時用pLXSN作為空載體轉(zhuǎn)染對照。4、細胞耐藥性及細胞對ADM、COL半數(shù)抑制量（IC50） 的測定采用MTT法3。5、細胞膜上P-糖蛋白（P-GP）免疫組化染色采用ABC法4。結(jié)果一、反義核酸逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSN-AS(+)的構(gòu)建1 383bp的mdr1 cDNA片段，

10、與pLXSN脫磷酸化載體加入T4 DNA連接酶，連接液常規(guī)方法導入大腸桿菌JM109中，挑選經(jīng)Amp篩選的3個轉(zhuǎn)化子，小量擴增，提取質(zhì)粒。用Hind酶切鑒定插入方向，結(jié)果見1所示。轉(zhuǎn)化子3為正向插入，在5'-LTR啟動子作用下能轉(zhuǎn)錄出mdr1 mRNA反義RNA。    1pLXSN-AS(+)的篩選結(jié)果(0.8%瓊脂糖凝膠)1.DNA/Hind+EcoR標樣；2.重組子1+Hind；3.重組子2+Hind；4.重組子3+Hind    2pLXSN-AS(+)的限制性酶切分析結(jié)果(0.8%瓊脂糖凝膠)1.

11、pLXSN-AS(+)無酶對照；2.pLXSN-AS(+)+BamH；3.pLXSN-AS(+)+Hind；4.pLXSN-AS(+)+EcoR；5.pLXSN-AS(+)+EcoR+Hind；6.DNA/Hind+EcoR標樣pLXSN-AS(+)經(jīng)大量擴增，限制性酶蘢?汲?dr1 mRNA反義RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，然后將該質(zhì)粒導入耐藥的膀胱癌細胞系BHA-60中，觀察反義核酸對MDR的逆轉(zhuǎn)效應。報告如下。材料與方法一、材料1、BIU-87 細胞：人膀胱癌移行上皮細胞系，引自北京醫(yī)科大學泌尿外科研究所。BHA-60細胞為本實驗室應用轉(zhuǎn)基因方法建立的多藥耐藥細胞系1。2、pLXSN：逆轉(zhuǎn)錄病

12、毒載體，在其多克隆位點上游含啟動子5- LTR，在其多克隆位點下游含SV-40啟動子和Neo基因，由美國Miller教授惠贈。質(zhì)粒pHDR5A由美國Gottesman教授2惠贈。3、主要試劑：（1）脂質(zhì)體（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取試劑盒、DNA快速連接試劑盒，購自德國Boehringer Mannheim公司。（2）G418為美國Gibercol BRL公司產(chǎn)品，用20mmol/L的HEPES稀釋成100g/l，0.2m過濾器過濾除菌，分裝后保存于-20備用。二、方法1、細胞培養(yǎng)：細胞置于37，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%新生小牛血清的RPMI-1640

13、。2、反義核酸質(zhì)粒的構(gòu)建：用EcoR I酶切質(zhì)粒pHDR5A，獲得1 383bp長的mdr1 cDNA；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN經(jīng)EcoR I酶切后經(jīng)CIAP脫磷酸化，制備線性化載體，將mdr1 cDNA與線性化pLXSN載體連接，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，再用Hind 酶切鑒定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSN-AS （+）， 該質(zhì)粒能在細胞內(nèi)表達長1 383nt的mdr1 mRNA的反義RNA。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pLXSN-AS（+）對細胞BHA-60的轉(zhuǎn)染：按說明書進行操作。選擇性培養(yǎng)基為含G418（終濃度

14、為800g/ml）的1640培養(yǎng)基，定期更換新鮮培養(yǎng)液，共選擇培養(yǎng)1416天，長出肉眼可見克隆，該細胞系命名為BHA-AS。同時用pLXSN作為空載體轉(zhuǎn)染對照。4、細胞耐藥性及細胞對ADM、COLZ討論20多年前，當人們首次在微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)基因表達過程中出現(xiàn)RNA-RNA互補現(xiàn)象時，提出了任何基因的功能都可以通過反義核酸加以抑制的假設(shè)5。1978年Hastic等6首先在體外實驗中實現(xiàn)這一假設(shè)，Zameenik等7應用反義寡核苷酸（aODN）在Rous肉瘤病毒復制研究過程中實現(xiàn)了細胞培養(yǎng)條件下的基因阻斷。反義核酸阻斷基因表達的機制是與靶RNA以堿基互補原則相結(jié)合，形成的DNA-RNA復合物是細胞

15、內(nèi)RNA酶H的作用底物，易被RNA酶H所破壞，另一方面，DNA-RNA復合物和RNA-RNA復合物阻斷了mRNA的轉(zhuǎn)錄或mRNA與某些轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成8。Quattrone等9將10mmol/L的18mer的aODN與人源性大腸癌細胞系共同孵育15天，結(jié)果該細胞系的耐藥性下降50%。Tominaga等10在研究P-GP 與氯離子通道活性時也發(fā)現(xiàn)aODN能顯著降低P-GP的合成。盡管aODN有易于合成和較高阻斷活性等特點，但對導入的aODN數(shù)量要求較高，且多為短期效應。本實驗將mdr1 cDNA 1 383bp片段亞克隆于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN上，重組出能在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出反

16、義核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)導入到靶細胞后能在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出1 383nt的mdr1 mRNA反義核酸。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pLXSN-AS（+） 后，細胞對ADM的耐藥性顯著降低；免疫組化染色也表明，細胞膜P-GP含量明顯減少。由于重組反義核酸避免了aODN需要反復導入等弱點，反義核酸能在重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒導入細胞后能長期表達，從而達到有效的逆轉(zhuǎn)MDR的目的。反義核酸進行MDR逆轉(zhuǎn)也有其缺點，由于重組的反義核酸較長，轉(zhuǎn)錄后有可能形成自身折疊結(jié)構(gòu)，影響其與靶RNA的結(jié)合，因而逆轉(zhuǎn)的效應并不完全。另外，反義核酸的作用還受到細胞內(nèi)其它因素如核蛋白等的影響。盡管如此，反義核酸仍不失為一種較好逆轉(zhuǎn)MDR的

17、方法?；痦椖浚罕菊n題受國家自然科學基金資助(39670824)作者單位：何斌（400037重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院泌尿外科）楊唐俊（400037重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院泌尿外科）金歡勝（400037重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院泌尿外科）王祥衛(wèi)（400037重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院泌尿外科）劉素英（400037重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院泌尿外科）曾毅（400037重慶第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院泌尿外科）金錫御（附屬西南醫(yī)院泌尿外科）參考文獻：1何斌，金錫御，楊唐俊，等.轉(zhuǎn)基因方法建立一種新的多藥耐藥細胞系.中華泌尿外科雜志，1999，20403-405.2Ueda K, Carda

18、relli C, Gottesman MM,et al. Expression of a full-length cDNA for the human MDR1 gene confers resistance to colchicine,docorubicin,and vinblastine. Proc Natl Acad Sci USA,1987,843004-3008.3陳鵬，劉敘儀，赫復生.耐順鉑人肺腺癌細胞系A(chǔ)549/cDDP的建立及耐藥機制.中國腫瘤臨床，1995，3582-587.4蔡文琴，王伯云.實用免疫細胞化學和核酸分子雜交技術(shù).第1版.成都：四川科學技術(shù)出版社， 1994，119-121.5Eguchi Y，Itoh T,Tomizawa.Antisense RNA. Annu Rev Biochem,1991,60631-652.6Hastie ND,Held WA. Analysis of mRNA populations by cDNA-mRNA hybridmediated inhibition of cell-free pro