Rho家族蛋白在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中作用

1、Rho家族蛋白在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中作用         【關(guān)鍵詞】  惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因。人類對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究已經(jīng)有一百多年歷史，隨著對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移基因調(diào)控多階段、多因素、多步驟理論的不斷完善，對(duì)于這一復(fù)雜病理過程有了更深入的認(rèn)識(shí)。發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的基因成為當(dāng)前腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的熱點(diǎn)，因?yàn)檫@些基因及其產(chǎn)物可能成為腫瘤抗轉(zhuǎn)移治療新的靶點(diǎn)或觀察患者預(yù)后的重要指標(biāo)。Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被克隆出來的蛋白，它們是一組相對(duì)分子質(zhì)量大約為2025kD的三

2、磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，因此，習(xí)慣被稱為Rho GTP酶，Rho GTP酶在細(xì)胞骨架重組調(diào)控方面起重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Rho GTP酶在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并和腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本文主要從腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘附以及細(xì)胞骨架重組等幾個(gè)方面，對(duì)Rho GTP酶作用于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機(jī)制綜述如下。1  Rho GTP酶到目前為止，Rho GTP酶超家族已發(fā)現(xiàn)約20個(gè)成員，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同，大致分為5個(gè)亞家族，包括：(1)Rho亞家族，包括RhoA、RhoB和RhoC，在序列上具有

3、高度同源性，并在多種細(xì)胞中高表達(dá)，主要參與張力纖維形成和粘著斑復(fù)合體(focal adhesion complexs，F(xiàn)ACs)組裝；(2)Rac亞家族：包括Rac1、Rac2、Rac3和RhoG，促進(jìn)層狀偽足和胞膜皺褶形成；(3)Cdc42亞家族，包括Cdc42、TC10、TCL、Wrch1和chp/Wrch2，其中Cdc42促進(jìn)絲狀偽足形成：(4)Rnd亞家族：包括Rnd1、Rnd3/RhoE和Rnd2，在細(xì)胞中組成性激活表達(dá)并具有不同的組織分布，可拮抗Rho信號(hào)通路；(5)Rho BTB亞家族，包括Rho BTB1和Rho BTB2，具體功能尚不清楚。在所有Rho GTP酶超家族成員中，

4、Cdc42、Rac1和RhoA是目前研究最多的Rho GTP酶。Rho家族各成員在氨基酸序列上有50%55%的同源性，在靠近催化位點(diǎn)處都有1個(gè)能和GTP結(jié)合的功能區(qū),與催化GTP水解密切相關(guān)。Rho GTP酶同Ras超家族的其他成員一樣，羧基端通常具有共同結(jié)構(gòu)域，即由半胱氨酸殘基，脂族殘基和其他氨基酸殘基組成的末端，是翻譯后修飾的位點(diǎn)。Rho GTP酶的翻譯后修飾與其質(zhì)膜定位有關(guān)，只有經(jīng)翻譯后修飾的Rho GTP酶才具有活性并能與細(xì)胞膜上適宜的脂質(zhì)分子結(jié)合。在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的作用下，半胱氨酸的巰基和異戊二烯基團(tuán)間共價(jià)形成硫醚鍵，并在內(nèi)切酶的作用下水解掉末端其余3個(gè)殘基，最后異戊二烯基化的半胱氨

5、酸殘基在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生甲基化，完成翻譯后的修飾。Rho家族蛋白同Ras超家族的所有成員一樣在活性型/GTP限制型和失活型/二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)限制型構(gòu)象之間循環(huán)。調(diào)節(jié)這個(gè)循環(huán)過程的3類重要蛋白是：(1)鳥苷酸交換因子(guaninenucleotide exchanging factors，GEFs)，催化GDP的釋放和GTP的結(jié)合，活化Rho GTP酶。不同的Rho GEF在結(jié)構(gòu)上都具有相同的功能域，包含1個(gè)DH(Dbl homology domain)區(qū)和1個(gè)PH(pleckstrin homologyv domain)區(qū)，前者與Rho

6、GTP酶結(jié)合并催化其構(gòu)象改變，后者通過和細(xì)胞膜上特定的脂質(zhì)作用使GEF在膜上定位；(2)GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)，作為負(fù)向調(diào)節(jié)因子加速Rho GTP酶的水解，使Rho GTP酶由活性狀態(tài)變?yōu)闊o(wú)活性狀態(tài)；(3)GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)，阻止GDP從Rho GTP酶上分離，抑制Rho GTP酶活性。Rho GTP酶是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，作為分子開關(guān)在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮橋梁作用。Rho GTP酶可參與對(duì)正常細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)，并與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)

7、，在多種腫瘤中可見Rho GTP酶表達(dá)異常，改變細(xì)胞內(nèi)Rho GTP酶的表達(dá)水平可以直接影響腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。2  Rho GTP酶與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞在基質(zhì)中的運(yùn)動(dòng)由4個(gè)循環(huán)往復(fù)的步驟組成，即頭部偽足的形成和延伸，新粘附位點(diǎn)的建立，胞體的收縮以及尾部的退縮，通過不斷重復(fù)的4個(gè)過程向前遷移。對(duì)這一過程精確調(diào)節(jié)的分子機(jī)制非常復(fù)雜，涉及胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在多條信號(hào)級(jí)連反應(yīng)通路中，Rho GTP酶尤其是RhoA、Rac1和Cdc42是關(guān)鍵的調(diào)控因子，主要參與對(duì)細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞與基質(zhì)粘附及細(xì)胞骨架重組的調(diào)控，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程。21  細(xì)胞形態(tài)改變

8、0; 偽足形成和細(xì)胞形態(tài)改變是侵襲轉(zhuǎn)移的起始步驟。Rac可誘導(dǎo)質(zhì)膜突起形成片狀樣的層狀偽足，而Cdc42誘導(dǎo)指頭樣突起的絲狀偽足形成。在高侵襲和轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞，還可見一種侵襲偽足形成，由于與細(xì)胞外基質(zhì)降解密切相關(guān)，可能成為主要的偽足結(jié)構(gòu)。層狀偽足與周圍基質(zhì)形成粘附連接，產(chǎn)生細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)的錨著位點(diǎn)；絲狀偽足有助于細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境的適應(yīng)及確定細(xì)胞遷移的方向。WiskottAldrich綜合征蛋白家族(WiskottAldrich syndrome protein，WASP)是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵分子，包括神經(jīng)組織來源WASP(neural WiskottAldrich syndrome protei

9、n，NWASP)，WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP family verprolinhomologous protein1，WAVE1)，WASP家族富含脯氨酸同源蛋白2(WASP familyverprolinhomologous protein2，WAVE2)等成員，也是Rac和Cdc42下游的重要效應(yīng)子，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，Rac和Cdc42通過活化WASP家族成員誘導(dǎo)偽足形成和基質(zhì)降解。Lorenz等首次使用熒光共振能量傳感器區(qū)分活性狀態(tài)和失活狀態(tài)的NWASP構(gòu)象，并模擬內(nèi)源性NWASP功能發(fā)現(xiàn)，NWASP在遷移的腫瘤細(xì)胞頭部層狀偽足形成中起重要作用。細(xì)胞遷移頭部高度動(dòng)態(tài)性偽

10、足結(jié)構(gòu)的形成依賴肌動(dòng)蛋白單體聚合和肌動(dòng)蛋白纖維的延長(zhǎng)，WASP家族不同成員通過不同的結(jié)構(gòu)域與Rac和Cdc42結(jié)合而活化，而肌動(dòng)蛋白相關(guān)2/3復(fù)合體(actinrelated 2/3 complexs，Arp2/3 complexs)和肌動(dòng)蛋白單體通過分別結(jié)合于活化的WASP家族羧基端共同的結(jié)構(gòu)域，直接調(diào)控肌動(dòng)蛋白單體聚合。Arp2/3復(fù)合體是肌動(dòng)蛋白組裝的核心，可將肌動(dòng)蛋白單體從頭合成組裝為肌動(dòng)蛋白絲，進(jìn)而促進(jìn)絲狀偽足和層狀偽足的形成。Arp2/3復(fù)合體與WASP的結(jié)合是調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合的重要因素，兩者在多種腫瘤細(xì)胞中共表達(dá)，對(duì)115例肺腺癌組織切片免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，78例(678)共表達(dá)A

11、rp2/3和WAVE2，并與病人臨床生存時(shí)間負(fù)相關(guān)；多變量回歸分析揭示，Arp2/3和WAVE2的共表達(dá)是腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。并且NWASP和Arp2/3復(fù)合體也是高侵襲和轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞侵襲偽足形成的主要調(diào)節(jié)子，并可能成為腫瘤治療的重要靶位11。肌動(dòng)蛋白單體的聚合和偽足形成還依賴另一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)子cofilin，cofilin可使肌動(dòng)蛋白單體從肌動(dòng)蛋白絲的頂端解離，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲從頭部折斷，產(chǎn)生新的末端。Rac和Cdc42可通過活化共同的底物p21激活激酶(p21activated kinase，PAK)，分別激活LIM(3種同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白lin11、isl1和mec3)激酶1(LIM

12、kinase1，LIMK1)和LIM激酶2(LIM kinase2，LIMK2)，磷酸化cofilin使其失活而抑制肌動(dòng)蛋白的解聚，穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。22  細(xì)胞基質(zhì)粘附  偽足形成啟動(dòng)細(xì)胞遷移的過程，但細(xì)胞持續(xù)的遷移需依賴細(xì)胞偽足與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的穩(wěn)定粘附，提供細(xì)胞向前遷移的牽引支點(diǎn)。遷移的細(xì)胞頭部與ECM的粘附和尾部與ECM的去粘附的不斷交替使得細(xì)胞向前遷移，Rho GTP酶對(duì)這一過程發(fā)揮精確的調(diào)節(jié)。細(xì)胞表面的整合素受體與ECM中特異的配體結(jié)合，通過整合素聚集成簇而形成FACs，而整合素受體的胞內(nèi)區(qū)與樁蛋白(paxil

13、lin)，紐蛋白(vinculin)和踝蛋白(talin)等多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白相互作用形成分子橋，并與細(xì)胞骨架相連，提供細(xì)         胞遷移的錨著位點(diǎn)?；罨腞ac可誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白的聚合和層狀偽足的形成，同時(shí)也能誘導(dǎo)新的FACs的形成，而FACs的形成又能反過來活化Rac，這一正反饋的失控可增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Jung發(fā)現(xiàn)，活化的Rac1和Cdc42，可通過激活PAKl磷酸化下游的粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，活化的FAK作為分子支架招募胞漿中樁蛋白，紐蛋白和踝蛋白等至

14、FACs，促進(jìn)FACs的形成。p65激活激酶還可通過LIMK間接調(diào)節(jié)cofilin的活性，cofilin在活性型和失活型間的循環(huán)可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白亞單位從肌動(dòng)蛋白絲末端的解離和聚合，并對(duì)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白纖維組裝時(shí)踏車(treadmilling)現(xiàn)象的發(fā)生非常必要。腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移與ECM的降解密切相關(guān)，Rho GTP酶可直接或間接調(diào)節(jié)下游效應(yīng)子促進(jìn)ECM的降解。對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDAMB435的研究發(fā)現(xiàn)，Rac1和Cdc42可通過間接活化LIMKl上調(diào)絲氨酸蛋白酶尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase type plasminogen activator，uPA)系統(tǒng)，增加uPA啟動(dòng)子活性，誘導(dǎo)

15、uPA和uPA受體mRNA和蛋白表達(dá)及uPA的分泌，降解ECM膠原等成分，有助于細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。23  細(xì)胞骨架重組  侵襲和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞的持續(xù)運(yùn)動(dòng)需依靠張力纖維收縮和肌動(dòng)蛋白絲的延長(zhǎng)提供動(dòng)力，Rho GTP酶可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。張力纖維是真核細(xì)胞中一種穩(wěn)定的、平行排列的微絲結(jié)構(gòu)，由肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等組成，肌動(dòng)肌球蛋白相對(duì)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的收縮力是細(xì)胞遷移動(dòng)力的主要來源。Rho及其下游的Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK)可提升肌球蛋白輕

16、鏈(myosin light chain，MLC)的磷酸化水平，增加肌動(dòng)-肌球蛋白的收縮力促使細(xì)胞在ECM中的遷移。ROCK是Rho下游的重要效應(yīng)分子，包括Rho激酶和p160ROCK 2個(gè)成員?；罨腞OCK通過2條通路提升MLC的磷酸化水平，一方面ROCK磷酸化其底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的肌球蛋白結(jié)合亞單位(myosinbinding subunit，MBS)而抑制MLCP的磷酸酶活性，減少M(fèi)LC磷酸基團(tuán)的水解；另一方面，ROCK可直接磷酸化MLC，增加MLC的磷酸化水平，從而增加與肌動(dòng)蛋白絲交聯(lián)產(chǎn)生的收縮力。抑制Rh

17、o/Rock通路能抑制腫瘤細(xì)胞張力纖維的收縮和細(xì)胞侵襲，顯性激活(dominant active)的p160ROCK的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲和遷移能力，而用p160ROCK的反義寡核苷酸處理的癌細(xì)胞侵襲和遷移能力可顯著減弱。Rho還可作用于下游另一重要效應(yīng)分子mDia(Mammalian Diaphanousrelated protein)蛋白，活化的mDia蛋白可將肌動(dòng)蛋白單體參入到肌動(dòng)蛋白絲的末端，并阻止成帽蛋白的結(jié)合，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白絲的延長(zhǎng)，有助于細(xì)胞遷移。3  Rho GTP酶在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移診斷和治療中的意義由于Rho GTP酶在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，因此，Rho

18、 GTP酶可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床診斷指標(biāo)。對(duì)53例胃癌病人和7名胃腫瘤細(xì)胞株的Rho超家族7名主要成員RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3和Cdc42mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RhoA、Rac1和Cdc42在胃癌組織切片中的平均表達(dá)水平顯著高于癌旁組織切片，RhoA的表達(dá)水平與腫瘤分期顯著正相關(guān)并和組織分化程度負(fù)相關(guān)，RhoA和Rac1在7種胃腫瘤細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平，總蛋白量及活性都顯著高于正常胃粘膜上皮細(xì)胞株16。RhoC在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，特別是在轉(zhuǎn)移性腫瘤中表達(dá)異常增高17。在原發(fā)胃癌細(xì)胞中RhoC的表達(dá)顯著高于正常胃上皮細(xì)胞，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)胃癌

19、中RhoC的表達(dá)顯著高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌，在有多個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)胃癌中RhoC的表達(dá)也顯著高于較少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞，穿過漿膜的胃癌細(xì)胞比在胃壁中的胃癌細(xì)胞具有更高的RhoC表達(dá)，表明RhoC的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的高度浸潤(rùn)相關(guān)，提示RhoC可作為胃癌病人臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。鑒于Rho GTP酶與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，使其可能成為轉(zhuǎn)移性腫瘤臨床轉(zhuǎn)移及預(yù)后分析的重要指標(biāo)。由于Rho GTP酶與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Rho GTP酶及其下游靶分子可能成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的重要靶位。特異性的ROCK抑制劑Wf536可在體內(nèi)抑制小鼠Lewis肺癌轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的新生毛細(xì)血管生成，并在體外抑制腫瘤細(xì)胞

20、在基質(zhì)膠上的侵襲和遷移18。由于Rho GTP酶翻譯后羧基端的修飾對(duì)于其正確的膜定位和活化非常重要，因此多種異戊烯基轉(zhuǎn)移酶抑制劑如Zarnestra，Sarasar，L778等2，通過阻斷Rho GTP酶C端翻譯后修飾位點(diǎn)的蛋白質(zhì)法呢基化，已被證實(shí)在腫瘤治療中有較好療效，而且針對(duì)某一種Rho GTP酶(如RhoA、RhoB、Rac1或Cdc42)的特異性異戊烯基轉(zhuǎn)移酶抑制劑將具有更好的臨床治療效果19。由于針對(duì)Rho GTP酶進(jìn)行的腫瘤治療能夠減少傳統(tǒng)抗癌藥物的副作用，因此,Rho GTP酶已成為腫瘤藥物開發(fā)的新靶位，對(duì)于腫瘤的臨床治療將具有良好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1  Burrid

21、ge K,Wennerberg K.Rho and rac take center stageJ.Cell,2004,116(2):167-197.2  Walker K,Olson MF.Targeting Ras and Rho GTPases as opportunities for cancer therapeuticsJ.Curr Opin Genet Dev,2005,15(1):62-68.3  Raftopoulou M,Hall A.Cell migration:Rho GTPases lead the wayJ.Dev Biol,2004,265(1):

22、23-32.4  Wheeler AP,Ridley AJ.Why three Rho Proteins?RhoA,RhoB,RhoC,and cell motilityJ.Exp Cell Res,2004,30(1):43-49.5  Yamguchi H,Lorenz M,Kempiak S,et al.Molecular mechanisms of invadopodium formation:the role of the NWASPArp2/3 complex patheway and cofilinJ.J Cell Biol,2005,168(3):441-4

23、52.6  Yamazaki D,Kurisu S,Takenawa T.Regulation of cancer cell motility through actin reorganizationJ.Cancer Sci,2005,96(7):379-386.7  Lorenz M,Yamaguchi H,Wang Y,et al.Imaging sites of Nwasp activity in lamellipodia and invadopodia of carcinoma cellsJ.Curr Biol,2004,14(8):697-703.8 

24、Yamazaki D,Kurisu,S,Takenawa T.Regulation of cancer cell motility through actin reorganizationJ.Cancer Sci,2005,96(7):379-386.9  Li S,Guan JL,Chien S.Biochemistry and biomechanics of cell motilityJ.Cancer Sci,2005,7:105-150.10  Semba S,Iwaya K,Matsubayashi J,et al,Coexpression of actinrela

25、ted protein 2 and WiskottAldrich syndrome family verprolinehomologous protein 2 in adenocarcinoma of the lungJ.Clin Cancer Res,2006，12(8):2449-2454.11  Yamaguchi H,Lorenz M,Kempi         u J,et al.Inhibition of motile and invasive properties of ovarian cancer