野菊花高效液相色譜指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立

1、野菊花高效液相色譜指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的建立                              作者：劉婷娜 朱恩圓 侴桂新 王崢濤【摘要】  目的建立野菊花的高效液相色譜指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，研究不同采集地和不同種野菊花藥材的質(zhì)量。方法利用RP-HPLC方法，分析了12批市售和8批采自

2、不同產(chǎn)地的野菊花藥材。流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.1醋酸水溶液，梯度洗脫，流速：1.0 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm。結(jié)果在45 min內(nèi)建立了野菊花HPLC指紋圖譜，確定了野菊花藥材中的22個(gè)共有峰,歸屬了其中的黃酮類化合物，并對(duì)其中黃酮類成分進(jìn)行主成分分析。結(jié)論野菊花藥材的反相高效液相色譜指紋圖譜，重復(fù)性好，在野菊花分類學(xué)上有一定的指導(dǎo)意義，用于野菊花的質(zhì)量評(píng)價(jià)可行。 【關(guān)鍵詞】  野菊花 高效液相色譜法 指紋圖譜 質(zhì)量評(píng)價(jià)    Abstract：ObjectiveTo evaluate the quality of Flo

3、s Chrysanthemi Indici by HPLC fingerprint and the component analysis.MethodsRP-HPLC was used for the determination of fingerprint. The separation was achieved on a C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 m). The mobile phase was a mixture of acetonitrile(A) and 0.01 Acetic acid(B) in gradient elution, the

4、 flowrate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 326 nmResultsThe HPLC fingerprint of Flos Chrysanthemi Indici was set up within 45 minutes and 22 characteristic peaks were shown to compare the flavonoids in different origins and different species in Flos Chrysanthemi Indici. Conclu

5、sionThe RP-HPLC fingerprint method is repeatable, feasible in the quality control of Flos Chrysanthemi Indici and can be used to identify the different species of Flos Chrysanthemi Indici    Key words：Flos Chrysanthemi Indici;  HPLC;  Fingerprint;  Quality evaluation

6、60;   野菊花是我國(guó)大部分地區(qū)民間常用中草藥之一，有清熱解毒、平肝明目的功效,秋冬二季花初開放時(shí)采摘，曬干或蒸后曬干入藥1。2005版藥典部規(guī)定，野菊花來源于菊科菊屬植物野菊Dendranthemae indicum L.的頭狀花序。而在民間用藥中，野菊變種及北野菊D. boreale Mak，菊花腦D. nankingense Hand.-Mazz或巖香菊(又稱甘菊) D. lavandulaefolium (Fish)Mak及其變種也做野菊花用2。目前，藥材市場(chǎng)上流通的野菊花主要來源于植物野菊和甘菊，或者野菊和甘菊兩者混合品。野菊、甘菊兩者植物形態(tài)相近，鑒定比較困難

7、，質(zhì)量上難以得到控制。2005版中國(guó)藥典野菊花含量測(cè)定項(xiàng)下僅測(cè)定了野菊中蒙花苷的含量，不能對(duì)野菊花的質(zhì)量進(jìn)行全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)。本文采用高效液相色譜法對(duì)野菊花商品藥材和自己采集的不同產(chǎn)地的野菊花藥材進(jìn)行指紋圖譜研究，并對(duì)其主要活性成分黃酮類成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，建立野菊花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的分析方法，為野菊花藥材的質(zhì)量控制提供有效方法，對(duì)進(jìn)一步提高野菊花的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法以及在野菊花植物化學(xué)分類學(xué)上具有一定的指導(dǎo)意義36。    1   儀器與材料    Dionex Summit P680 DGP system 型液相色譜儀，P

8、DA 100二極管陣列檢測(cè)器，變色龍色譜工作站。對(duì)照品：綠原酸購自上海滬云醫(yī)藥有限公司；蒙花苷由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化中心提供；木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（木犀草苷）芹菜素為自制(從野菊D. indicum  L中分離得到，經(jīng)核磁和質(zhì)譜鑒定后確定，采用歸一化法含量，HPLC檢測(cè)純度>98)；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。野菊花購自全國(guó)各藥店12批和采集自不同產(chǎn)地的8批(采集的藥材經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)吳立宏副研究員和安徽中醫(yī)學(xué)院劉守金副教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心藥材標(biāo)本室)。藥材情況見表12。表1  12批市售野菊花樣品的來源 &

9、#160;  2  方法與結(jié)果26    2.1  色譜條件與系統(tǒng)適用性色譜柱 Acclaim 120 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 m)；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為01醋酸水溶液，梯度洗脫，流動(dòng)相變化比例見表3，流速：1.0 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；柱溫；30；進(jìn)樣量：10 l。以木犀草素的色譜峰(12號(hào)峰)計(jì)算理論塔板數(shù)不低于5 000。表2  8批采集得到的野菊花樣品的產(chǎn)地及植物來源表3  梯度洗脫流動(dòng)相的比例    2.2

10、60; 對(duì)照品溶液的制備稱取木犀草素、綠原酸、木犀草苷、蒙花苷、芹菜素對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 ml量瓶中,精密加入乙腈-甲醇-水（211）溶劑溶解稀釋至刻度，制成對(duì)照品混標(biāo)溶液。    2.3  供試品溶液的制備精密稱取野菊花藥材粉末(過4號(hào)篩)0.5 g,置于100 ml三角燒瓶中,精密加入甲醇-醋酸乙酯（11）25 ml, 超聲30 min，放冷，補(bǔ)足重量。取續(xù)濾液，經(jīng)微孔濾膜(0.45 m)過濾后，取續(xù)濾液制成供試品溶液。    2.4  精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取野菊花供試品溶液，在上述色譜條件下，重復(fù)

11、進(jìn)樣6次，記錄色譜指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰與木犀草素內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0 ，符合指紋圖譜要求。    2.5  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取野菊花樣品(收集自蘇州)6份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰與內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD均小于5.0 ，符合指紋圖譜要求。    2.6  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取供試品溶液，于室溫下放置，分別在0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算各色譜峰與內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其RSD均小于5.0 ，

12、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野菊花樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。    2.7  結(jié)果野菊花藥材指紋圖譜中的特征峰以經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的12批野菊花藥材為研究對(duì)象，進(jìn)行指紋圖譜研究。共確認(rèn)了22個(gè)色譜峰。通過比對(duì)保留時(shí)間和紫外吸收?qǐng)D譜的方法，指認(rèn)了5個(gè)色譜峰，分別為綠原酸(1號(hào)峰)、木犀草苷(3號(hào)峰)、蒙花苷(11號(hào)峰)、木犀草素(12號(hào)峰)、芹菜素(16號(hào)峰)。典型圖譜、市售野菊花色譜圖、采集得到的野菊花色譜圖見圖13。1             圖1 

13、; 野菊花藥材(購自北京)的高效液相色譜圖    其中：1，2，4，5，6，7號(hào)色譜峰的紫外吸收?qǐng)D與綠原酸相似，應(yīng)為綠原酸同系物， 3，8，10，11，12，13，16，17，18，19，20號(hào)色譜峰為黃酮類化合物。    2.7.1  12批市售藥材中黃酮類成分的主成分分析采用多變量統(tǒng)計(jì)軟件MVSP軟件對(duì)12批市售藥材的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。結(jié)果如圖4。結(jié)果可見，市場(chǎng)上大部分藥材中的黃酮類成分的組成及含量較為相似，但個(gè)別來源的樣品相差較多。    圖2  12批市售野菊花藥材的高效

14、液相指紋圖譜    圖3  8批采自不同產(chǎn)地野菊花藥材的高效液相指紋圖譜    2.7.2  8批采集自不同產(chǎn)地的藥材黃酮類成分的主成分分析采用多變量統(tǒng)計(jì)軟件MVSP軟件8批采集的藥材的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖5。結(jié)果可見，產(chǎn)地不同的8批藥材聚成了2類，這與野菊花藥材的來源主要為野菊和甘菊兩類相吻合，并且與根據(jù)野菊花植物形態(tài)學(xué)上的鑒定結(jié)果相吻合，說明所建立的野菊花高效液相指紋圖譜及黃酮類成分的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)野菊花植物分類學(xué)上有一定指導(dǎo)意義。    圖4  12批藥材黃酮

15、類成分分析    2.7.2  8批采集自不同產(chǎn)地的藥材黃酮類成分的主成分分析采用多變量統(tǒng)計(jì)軟件MVSP軟件8批采集的藥材的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖5。結(jié)果可見，產(chǎn)地不同的8批藥材聚成了2類，這與野菊花藥材的來源主要為野菊和甘菊兩類相吻合，并且與根據(jù)野菊花植物形態(tài)學(xué)上的鑒定結(jié)果相吻合，說明所建立的野菊花高效液相指紋圖譜及黃酮類成分的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)野菊花植物分類學(xué)上有一定指導(dǎo)意義。    圖5  8批采集自不同產(chǎn)地的藥材中黃酮類成分的主成分分析    2.7.3  總收集

16、得到的藥材中黃酮類成分的主成分分析采用多變量統(tǒng)計(jì)軟件MVSP軟件對(duì)12批市售藥材和8批采集得到的野菊花色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖6。從市售樣品及采集得到的樣品色譜數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果可見，市售樣品并不與野菊和甘菊樣品聚為一類，而是單獨(dú)聚為一類，這說明其來源可能為兩者都有。    圖6  8批采集自不同產(chǎn)地的藥材中黃酮類成分的主成分分析    3  討論    本文采用RP-HPLC梯度洗脫的方法對(duì)20批不同來源的野菊花藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究，對(duì)其中的黃酮成分的分離取得了良好的效果。

17、在對(duì)20批不同來源的野菊花藥材進(jìn)行色譜分析的基礎(chǔ)上在45 min內(nèi)建立了野菊花的高相液相指紋圖譜，并且歸屬了22個(gè)共有峰，其中確定了5個(gè)共有峰分別為綠原酸、木犀草苷、木犀草素、蒙花苷、芹菜素。    提取條件的優(yōu)化：比較了水提醇沉，80乙醇回流，甲醇超聲，醋酸乙酯超聲，甲醇與醋酸乙酯不同比例混和溶劑超聲。其中醋酸乙酯與甲醇的混和溶劑提取出來的樣品色譜峰較豐富，絕大多數(shù)色譜峰的紫外吸收均顯示為黃酮類成分的特征吸收，且比較了醋酸乙酯甲醇比例為31，21，11，12各種溶劑系統(tǒng)提取得到的樣品圖譜，結(jié)果并無大差別，故選用醋酸乙酯-甲醇11為提取溶劑。比較溶劑超聲15，30

18、，45 min的提取效果，結(jié)果確認(rèn)超聲提取30 min為提取最佳時(shí)間。    檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：采用二極管陣列檢測(cè)器考察200400 nm不同檢測(cè)波長(zhǎng)圖譜。結(jié)果表明，326 nm的圖譜色譜信息豐富，因此選擇326 nm為指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。       色譜流動(dòng)相的選擇：經(jīng)考察甲醇-水溶液、乙腈-水、乙腈-醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等多種流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，采用乙腈-醋酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，對(duì)色譜峰的分離效果最好，各色譜峰均能實(shí)現(xiàn)良好的分離，最后確定乙腈-0.1%醋酸水為流動(dòng)相。    在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)綠原酸對(duì)照品在溶液狀