骨再生與干細(xì)胞

1、骨再生與干細(xì)胞摘要：本約稿主要覆蓋的研究領(lǐng)域是包括骨科和頜面骨組織修復(fù)的核心重要性。內(nèi)容包括正常的骨折愈合和治療問(wèn)題、組織工程的生物材料支架、間充質(zhì)和胚胎干細(xì)胞、性激素對(duì)間充質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞的影響、將富含血小板的血漿在組織修復(fù)、骨生成中的應(yīng)用以及對(duì)相關(guān)分子標(biāo)記物的研究。除了干細(xì)胞之外，我們還討論了各種各樣的細(xì)胞以及材料科學(xué)的進(jìn)展來(lái)滿足骨和軟組織再生特殊需求（通過(guò)添加生物活性分子）。關(guān)鍵詞：骨再生，干細(xì)胞，生物材料，聚合物，再生醫(yī)學(xué)。引言基于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的處理臨床問(wèn)題的新方法來(lái)源于基礎(chǔ)研究與臨床觀察的共同進(jìn)步?？茖W(xué)家們?cè)絹?lái)越意識(shí)這種“從實(shí)驗(yàn)室到病房”對(duì)于轉(zhuǎn)化研究確實(shí)是一種雙行道，它可以強(qiáng)化和加速研究過(guò)

2、程中的關(guān)鍵點(diǎn)。由于創(chuàng)傷性、病理性以及生理性骨吸收所引起的骨缺損是目前我們所面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn)，而且它還是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。腦外科、頜面外科及骨外科對(duì)骨再生的需求是修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)的一個(gè)核心臨床問(wèn)題。調(diào)查大量的骨缺損病人的社會(huì)和心理障礙問(wèn)題以及他們生活質(zhì)量的顯著下降非常困難。除了創(chuàng)傷意外，骨愈合問(wèn)題還與患者的年齡、性別、感染及已診斷為骨質(zhì)疏松癥,骨量減少和與牙齒丟失有關(guān)的嚴(yán)重牙科問(wèn)題有關(guān)。本綜述的目的是為了描述我們對(duì)骨折愈合和骨再生理解方式的現(xiàn)狀。骨折愈合及骨折治療問(wèn)題骨折后骨的修復(fù)不像其他結(jié)締組織一樣形成纖維瘢痕。它是一個(gè)細(xì)胞和分子反應(yīng)序貫性發(fā)生的特殊過(guò)程，最終形成新骨。這些形成新骨所需的一

3、系列有序事件的發(fā)生受全身和局部因子的調(diào)控，而這些有序時(shí)間發(fā)生溫暖撿回引起骨折愈合問(wèn)題。因此，為了確定何時(shí)干預(yù)以及怎樣干預(yù)以促進(jìn)骨折愈合并避免并發(fā)癥的發(fā)生，我們很有必要清楚的認(rèn)識(shí)新骨形成過(guò)程中的這些有序發(fā)生的事件及其調(diào)節(jié)過(guò)程。自人骨折愈合的早期組織學(xué)描述以來(lái)，基于軟骨內(nèi)骨化的骨折間接愈合的一般模式包括如下先后幾個(gè)時(shí)期：血腫機(jī)化期、炎癥期、血管生成期、軟骨及骨形成期，最后是骨重塑期?；谀?nèi)骨化的骨折直接愈合不伴有骨膜反應(yīng)以及骨痂形成，并不常見(jiàn)。以上提及的各時(shí)期的確切特點(diǎn)的形成需要細(xì)胞遷移及分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成及其向骨化方向的組織以及局部和全身調(diào)節(jié)的參與。除了骨折愈合經(jīng)典的組織學(xué)分期，關(guān)于這些過(guò)

4、程在細(xì)胞及分子水平的調(diào)節(jié)方面尚有很多需要我們理解。血腫的形成與血管的損傷有關(guān)，同時(shí)伴隨著炎癥反應(yīng)，該部位IL-1,IL-6以及腫瘤壞死因子等前炎癥細(xì)胞因子引起骨折愈合瀑布式反應(yīng)的發(fā)生，并將該過(guò)程推向軟骨內(nèi)骨的形成及骨的重塑。其次，除了局部缺血，生長(zhǎng)及分化因子，尤其是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族（包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白,血小板源性生長(zhǎng)因子，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及胰島素樣生長(zhǎng)因子）調(diào)節(jié)軟骨及骨形成過(guò)程的重要事件，這些事件包括趨化作用，間質(zhì)細(xì)胞及骨先質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，細(xì)胞外基質(zhì)骨化。最終，血管生成作為骨折愈合的一個(gè)關(guān)鍵性方面，也在分子水平受到調(diào)節(jié)。血管生成素通路在骨愈合的早期階段已經(jīng)被描述為一個(gè)與軟骨內(nèi)骨形成相關(guān)

5、的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子依賴通路，在該通路中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白刺激骨細(xì)胞和骨樣細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。抑制性的分子在控制生長(zhǎng)因子方面是必要的，各種骨形態(tài)發(fā)生蛋白的拮抗物質(zhì)分泌進(jìn)入細(xì)胞外間隙（如noggin,硬化抑素，卵泡抑素等）。其他抑制抑制機(jī)制包括對(duì)一種被定義為BAMBI的假受體相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族的某些成員的受體抑制，除其它機(jī)制外，好友通過(guò)激活I(lǐng)-Smads的細(xì)胞內(nèi)抑制機(jī)制。關(guān)于骨愈合的分子、細(xì)胞、事件的瀑布式發(fā)生過(guò)程的諸多方面已經(jīng)被證實(shí)，然而，其復(fù)雜的相互作用及過(guò)程仍然只是部分被理解。有趣的是, 盡管成人可用的骨先質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有限以及內(nèi)外機(jī)械力的強(qiáng)烈影響，成人的骨愈合除了會(huì)產(chǎn)生炎癥反

6、應(yīng)外，在胚胎時(shí)期正常發(fā)育。這個(gè)事實(shí)為研究人員提供了一個(gè)關(guān)于骨骼發(fā)生發(fā)育過(guò)程生物事件的寶貴線索12。在胚胎發(fā)生時(shí)期骨形成起始于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)聚集和凝結(jié)，然后通過(guò)軟骨形成進(jìn)展到軟骨內(nèi)骨化或通過(guò)成骨細(xì)胞分化進(jìn)展到膜內(nèi)骨化。 雖然間充質(zhì)干細(xì)胞在成人骨中比較缺乏，但是來(lái)自骨膜的先質(zhì)細(xì)胞和來(lái)自骨髓的未分化的多能間充質(zhì)干細(xì)胞都參與骨痂的形成，這在骨折愈合的結(jié)構(gòu)形成上是非常重要的。除了骨愈合經(jīng)典的三要素(細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和骨誘導(dǎo)因子)外，近來(lái)，第四個(gè)主要因素(骨痂的生物力學(xué)性能)越來(lái)月受到重視13、14。生物力學(xué)（機(jī)械力對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程的影響）對(duì)骨形成的骨各個(gè)階段都產(chǎn)生顯著的影響。 由于壓力可增加骨沉積

7、，不僅主要外力破壞可能愈合過(guò)程，影響軟骨內(nèi)骨化的機(jī)械負(fù)荷也非常重要 13，這個(gè)理論自19世紀(jì)來(lái)被經(jīng)驗(yàn)性的定義為Wolff定律。 然而，在骨生成的早期階段，盡管膜內(nèi)骨化可能在壓力和張力較低的區(qū)域發(fā)生，但是，如果施以循環(huán)運(yùn)動(dòng)聯(lián)合剪切應(yīng)力，細(xì)胞增殖會(huì)增強(qiáng)。細(xì)胞水平上的機(jī)械信號(hào)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架中分子的變化、調(diào)節(jié)整合素和離子通道活動(dòng)，而它們將引起參與骨愈合過(guò)程中細(xì)胞的分化和相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果。轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有對(duì)細(xì)胞的直接機(jī)械刺激15、16、流體剪切力、壓力以及不同的基體效應(yīng)對(duì)細(xì)胞的間接影響到17。在臨床研究顯示骨愈合早期碎骨塊間相互運(yùn)動(dòng)（大約0.6mm）有益之后，很多實(shí)驗(yàn)性研究得以發(fā)展起來(lái)18，機(jī)械刺激普遍被

8、認(rèn)為對(duì)愈合率有影響。盡管對(duì)骨折愈合的自然機(jī)制已深為了解，局部和全身因子的改變可能導(dǎo)致愈合不良。骨不愈合(或假關(guān)節(jié)形成)，在骨折不愈合部位發(fā)生的錯(cuò)誤結(jié)合，延遲愈合等是骨修復(fù)過(guò)程中的主要問(wèn)題，并且是重要的衛(wèi)生保健問(wèn)題。系統(tǒng)及局部因素皆對(duì)骨折愈合有影響，其中系統(tǒng)因素有：使用非甾體類抗炎藥物等系統(tǒng)性因素(在炎癥階段抑制環(huán)氧酶以及前列腺素), 年齡(介質(zhì)的表達(dá)降低，荷爾蒙的變化，成骨細(xì)胞功能受損)，或吸煙19。骨架的形成需要有機(jī)械穩(wěn)定性，專注于穩(wěn)定性的外科技術(shù)可大大提高骨折愈合的可能性，然而過(guò)量的運(yùn)動(dòng)將會(huì)造成不良影響。 在骨折固定穩(wěn)妥的情況下，骨痂形成過(guò)程中所需的血管生成和適當(dāng)?shù)慕M織形成，關(guān)鍵因子同樣得

9、到提高20。 然而，骨先祖細(xì)胞的分化率受機(jī)械環(huán)境的調(diào)節(jié)。因此成骨分化可能收到運(yùn)動(dòng)的破壞或者提高。拉伸應(yīng)變，它們可導(dǎo)致骨痂的斷裂，靜水壓和牽張應(yīng)力在兩骨折斷端引起纖維軟骨形成，正如Loboa et al等建立的模型一樣，形成的是假關(guān)節(jié)而非真正的骨愈合21。盡管外科治療骨折的手段已取得巨大進(jìn)步，處理骨折愈合的問(wèn)題仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，將會(huì)得益于對(duì)正常骨折愈合的深入了解，以及從此衍生出來(lái)的潛在治療手段。骨形成的生物材料支架及組織工程人體解剖學(xué)重建一直是重建醫(yī)學(xué)的目標(biāo)。目前,各種策略被用來(lái)來(lái)刺激骨缺陷愈合。盡管材料科學(xué)技術(shù)引起了骨再生領(lǐng)域的明顯進(jìn)步，尚未開(kāi)發(fā)一種能夠滿足骨替代物所有需求的材料，所以，處理大型

10、骨缺陷和損傷損傷仍是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。組織工程已經(jīng)以一個(gè)跨學(xué)科的領(lǐng)域出現(xiàn)，具有開(kāi)發(fā)和使用新材料的巨大潛能，可以用于快速增長(zhǎng)的再生醫(yī)學(xué)和牙科學(xué)市場(chǎng)。在這種背景下，生物材料在開(kāi)發(fā)組織工程器官過(guò)程中扮演著重要的角色?？山到馍锊牧峡捎糜谥圃煅芑?、與機(jī)體骨骼連接的支架，并使細(xì)胞互相靠近，刺激系新的具有活性的骨的形成，最后與機(jī)體的生物學(xué)系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)。制造材料以提供合適的支架，這種支架使對(duì)粘附細(xì)胞具有傳到性，并且能維持細(xì)胞功能，這是至關(guān)重要的。聚合物結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新，細(xì)胞適應(yīng)性和基本分子生物力學(xué)為開(kāi)發(fā)可降解物質(zhì)提供了可能性（這種物質(zhì)可以注射，成形，并且隨著附加材料的程序性降解消失，可以重建組織的形態(tài)和功能）。通

11、過(guò)控制親水性和表面納米或微米結(jié)構(gòu)，這可降解聚合物可成為良好的組織工程支架候選材料，并可促進(jìn)和優(yōu)化這種人工結(jié)構(gòu)中細(xì)胞的生長(zhǎng)。 因此基于細(xì)胞和生物材料的骨組織工程對(duì)于骨缺損的重建和再生是一個(gè)具有重要意義的概念。 然而，在這種方法可以被常規(guī)的應(yīng)用于臨床之前還有很多工作要做。骨是人體最堅(jiān)硬的組織之一，并且是骨骼的主要成分；它支持著軟組織結(jié)構(gòu)，保護(hù)重要器官（如顱中的和胸腔中的器官）和骨內(nèi)還包含有骨髓，在那里血細(xì)胞得以形成。此外,骨還形成一種杠桿系統(tǒng)，能夠復(fù)合骨骼肌收縮時(shí)產(chǎn)生的力量。并將這些力量轉(zhuǎn)換成身體的運(yùn)動(dòng)如散步和咀嚼等。骨頭也高度血管的組織，它作為礦物質(zhì)的儲(chǔ)備庫(kù)能夠維持體內(nèi)血鈣水平的穩(wěn)定22。骨組織

12、的形成要么通過(guò)膜內(nèi)骨化要么通過(guò)軟骨內(nèi)骨化。胚胎內(nèi)發(fā)育最早開(kāi)始于第四到第六周。膜性或直接骨化發(fā)生在部分頭骨或顱面骨骼，鎖骨和肩胛骨，這時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞增殖并逐漸改變形狀，它發(fā)生在一層結(jié)締組織中。軟骨內(nèi)或間接骨化發(fā)生在長(zhǎng)骨的軟骨模型和其余的骨骼，除了增加骨骼的長(zhǎng)度也通過(guò)同位的骨骼生長(zhǎng)增加寬度。 這種軟骨模型逐漸摧毀，取而代之的是成熟的骨骼，這種骨骼由相鄰的骨膜結(jié)締組織內(nèi)的細(xì)胞形成。 在這兩種過(guò)程中，骨組織最開(kāi)始以初級(jí)或不成熟的形式出現(xiàn)，并從出生后第一年到青春期發(fā)生迅速的生長(zhǎng)。 成人骨骼骨組織要么是以骨小梁形式排列要么是以緊湊模式排列23。 一種假設(shè)的股形成的第三中模式在牽引成骨研究中被描述。 類軟骨

13、性骨化通過(guò)軟骨產(chǎn)生骨。 研究者推測(cè)，肥厚性和/或早期軟骨細(xì)胞分化成骨樣細(xì)胞，導(dǎo)致骨頭沒(méi)有毛細(xì)管長(zhǎng)入。由于骨骼的發(fā)生是非常復(fù)雜的，盡管頭骨和面骨,脊柱,臀部,腿和腳最常發(fā)生骨缺損并導(dǎo)致不正常的外觀和功能，先天性骨缺陷可以發(fā)生在任何骨 24。最常見(jiàn)的顱面缺損是唇裂，腭裂和下頜畸形。大多數(shù)這些缺陷可以通過(guò)手術(shù)修復(fù)。通常，手術(shù)很復(fù)雜,包括重畸形的和缺損的身體部位25- 27。由于創(chuàng)傷、病理和生理骨吸收引起的骨缺陷仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。顱骨，頜面骨和骨科手術(shù)中骨再生的需求仍然是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題。大多數(shù)骨折應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的治療手段能夠愈合良好，大多數(shù)沒(méi)有任何疤痕組織的形成。然而，由于腫瘤切除術(shù)，無(wú)法愈合的骨折

14、，較大的創(chuàng)傷和無(wú)齒的下巴是重建的病例，并且如果沒(méi)有合適的治療將會(huì)造成嚴(yán)重的殘疾。在神經(jīng)外科中，脊柱融合在許多患有椎間盤退變的患者中實(shí)施，這個(gè)過(guò)程同樣需要骨移植。整形和重建外科醫(yī)生常規(guī)將自體骨移植作為填補(bǔ)和修復(fù)骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)28。 目前修復(fù)骨缺陷的臨床治療手段尚有不確定性，由于骨的解剖和和生理學(xué)，以及骨修復(fù)過(guò)程認(rèn)識(shí)的局限性，常常會(huì)導(dǎo)致不良的骨愈合。由于與自體移植相關(guān)的主要問(wèn)題，如組織不足，獲取組織部位的損傷以及出血、感染和慢性疼痛等手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，尋找一種替代療法是必要的。 骨骼缺損往往需要大量的骨，然而通常不可獲取。 獲取供體骨的部位通常是髂嵴，這就需要二次手術(shù)，同樣也有手術(shù)的并發(fā)癥。同種異體骨移植

15、可以得到使用,特別是在假體重建中，但是可能仍然不能解決骨缺損的許多問(wèn)題。由于存在與自體骨和同種異體骨移植相關(guān)的缺點(diǎn)，科學(xué)家們長(zhǎng)期以來(lái)一直在尋找具有生物相容性的可以替代骨移植的材料。盡管大多數(shù)可用的合成骨替代品與自體骨移植物有一些共同特性，迄今為止沒(méi)有一鐘合成材料能夠提供患者自體骨的所有優(yōu)點(diǎn)。例如,磷酸鈣生物陶瓷不具備重建大型骨缺陷的足夠的成骨性能 29、30。因此，盡管許多的骨替代材料在臨床應(yīng)用方面具有商業(yè)可用性，使用異質(zhì)成形的材料和自體骨移植仍然是治療骨缺損首選的方法 31。因此,在骨組織工程中，首先確定骨再生和植入的區(qū)域和功能具有重要意義。在這些情況下，整形外科，神經(jīng)外科、頜面外科和牙科植

16、體可能有不同的治療形式，針對(duì)不同的治療靶點(diǎn)，可能要求材料以固態(tài)或注射形式進(jìn)行使用。骨組織工程鑒于上述限制和對(duì)骨移植手術(shù)需求的不斷增加，外科醫(yī)生正在尋找一個(gè)更好的治療的方法。組織工程結(jié)合骨髓細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞，合成支架和分子信號(hào)(生長(zhǎng)或分化因子)以形成混合結(jié)構(gòu)。經(jīng)典的就是，骨組織工程的方法包括病人身上骨髓細(xì)胞的獲取，通過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)塑的粘附分離間充質(zhì)細(xì)胞，在培養(yǎng)過(guò)程中擴(kuò)增和分分MSC，然后，在將混合結(jié)構(gòu)植入該病人體內(nèi)之前將種子細(xì)胞接種到合適的合成支架上面 32。研究已證明植入少量(0.1 - 3毫升)種子細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)將增長(zhǎng)70%33。雖然這引起了一些倫理道德問(wèn)題，從骨髓中收集細(xì)胞仍

17、然是一個(gè)又創(chuàng)手術(shù)，另外，隨著個(gè)體的變老，干細(xì)胞數(shù)量可能會(huì)明顯減少。對(duì)可用細(xì)胞多能細(xì)胞來(lái)源的研究引起了對(duì)其他組織的研究調(diào)查，包括動(dòng)員外周血、臍帶血。而且最近，牙周韌帶和非永久性的和永久性的牙齒。牙髓組織也是一個(gè)容易獲得的牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源，并且可以輕松的得到分離，牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮和平滑肌標(biāo)記物STRO-134，并顯示一個(gè)外膜細(xì)胞表型，同時(shí)表達(dá)外膜細(xì)胞相關(guān)抗原3G534。 因此認(rèn)為牙髓中血管周圍區(qū)域是PDSC的小環(huán)境，周皮細(xì)胞引起牙髓干細(xì)胞的增加。分離的牙髓干細(xì)胞已被證明具有塑料粘附性，并且表達(dá)MSC的標(biāo)記物STRO-1和、CD90、CD29、CD44、CD166、CD105、

18、CD106、CD146、CD13，但是不表達(dá)CD14和CD3435、36。在體外,PDSC能夠自我更新，具有可塑性和多系潛力(脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞祖細(xì)胞和肌管)，因此可被定義為干細(xì)胞37。到目前為止，這些方法已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和小樣本臨床研究中進(jìn)行過(guò)評(píng)估，顯示結(jié)果不確定和低的骨再生功效38-40?？偟膩?lái)說(shuō),臨床結(jié)果令人失望，特別是在修復(fù)大型的骨缺損時(shí)。臨床研究的有限的成功可歸因于大量的問(wèn)題，主要與實(shí)驗(yàn)室程序向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化有關(guān)。 將實(shí)驗(yàn)室流程轉(zhuǎn)化為臨床有效的、可重復(fù)的、安全的、經(jīng)濟(jì)上可行的和具有競(jìng)爭(zhēng)力的產(chǎn)品是新的臨床技術(shù)開(kāi)發(fā)的一個(gè)復(fù)雜且具有挑戰(zhàn)性的階段32。在骨組織工程的背景下，

19、這些困難反映了這一概念的多學(xué)科性質(zhì)。生物材料支架骨組織工程利用支架傳遞生物因子，包括細(xì)胞、基因和蛋白質(zhì)以生成骨，血管形成的評(píng)估，最終成熟為結(jié)構(gòu)。為了確保成功的治療骨缺損，支架本身必須滿足三個(gè)主要功能。首先，支架必須提供正確的解剖學(xué)幾何結(jié)構(gòu)，來(lái)構(gòu)建和維護(hù)組織再生的空間。 第二，支架必須在組織缺陷部位提供暫時(shí)的機(jī)械負(fù)荷承受能力。第三，支手架應(yīng)能夠增強(qiáng)所選生物因子的再生能力；且平衡再生能力。 為了達(dá)到承重的目的，實(shí)現(xiàn)相當(dāng)于骨組織剛度和強(qiáng)度需要具有小孔的支架。相反提高傳遞生物因子的能力高度連接的多孔支架，以幫助支架中細(xì)胞遷移，血管和結(jié)締組織的形成。在臨床應(yīng)用中，匹配復(fù)雜解剖缺損需要用計(jì)算方法以及控制的

20、解剖形狀和結(jié)構(gòu)。許多不同的材料已經(jīng)被提出作為合成骨替代品。羥磷灰石(HA),Ca10(PO4)6(OH)2,被認(rèn)為是最有生物活性骨替代陶瓷由于其具有較好的骨傳導(dǎo)性能。 這適用于HA合成或生物起源、 (-TCP)和兩相的磷酸鈣。磷酸鈣生物材料目前正在被使用，例如,骨修復(fù)、替換、增加和再生。作為合成骨替代品，陶瓷的主要優(yōu)勢(shì)是比聚合物和金屬在活體內(nèi)有較優(yōu)良的生物相容性和穩(wěn)定性。合成磷酸八鈣已被證明是骨和牙齒內(nèi)生物磷灰石的一個(gè)不錯(cuò)的前體物質(zhì)，并且比其他磷酸鈣骨替代材料具有更好的骨再生和生物降解特性 41。 存在一個(gè)缺點(diǎn)就是，它有時(shí)是難以實(shí)現(xiàn)材料接近周圍的骨頭，尤其是在復(fù)雜的缺損處，并且這對(duì)完整的和成功

21、的骨再生是必需的。陶瓷另外一個(gè)普遍的缺點(diǎn)就是其固有的脆性。這個(gè)缺點(diǎn)可以通過(guò)將陶瓷與聚酯混合來(lái)克服，最終形成將機(jī)械強(qiáng)度和磷酸鈣的骨傳導(dǎo)性與細(xì)胞的高親和力和聚酯的生物降解能力相結(jié)合的復(fù)合物。復(fù)合材料的發(fā)展將基于羥基磷灰石的顆粒提供的加強(qiáng)活動(dòng)與可吸收聚合物的適合降解動(dòng)力學(xué)相結(jié)合，這種材料包含可降解基質(zhì)及剛性粒子42。許多研究已經(jīng)對(duì)生物陶瓷粒子如與可降解聚合物（如PCL,PLA）結(jié)合二氧化硅、羥基磷灰石或其他磷酸三鈣進(jìn)行過(guò)實(shí)驗(yàn)，來(lái)生產(chǎn)骨替代材料 (圖1)。使用這些系統(tǒng)的研究的陽(yáng)性結(jié)果可歸因于骨鈣化時(shí)期的結(jié)構(gòu)相似性，以i級(jí)骨傳到和骨連接特性 43-45。例如，與PCL支架相比，復(fù)合材料支架含有PCL及T

22、CP表現(xiàn)出較好的親水性、抗壓模量和力量。它們被設(shè)計(jì)應(yīng)用于負(fù)重部位。在該復(fù)合材料上的人類牙槽骨母細(xì)胞比生長(zhǎng)與生長(zhǎng)與PCL上的人類牙槽骨母細(xì)胞，表現(xiàn)出更高的播種效率，更好的增殖并且較早表達(dá)骨基質(zhì)相關(guān)蛋白46。該系統(tǒng)增加的磷酸鈣粒子產(chǎn)生針狀的、鈣缺失的HA晶體，這提高了該結(jié)構(gòu)的抗壓強(qiáng)度。這種材料因此滿足骨組織工程支架材料的許多主要要求47。機(jī)械性能也可以通過(guò)交聯(lián)提高。例如,交聯(lián)聚(丙烯酰胺)(圖2)及硫酸鈣/ -TCP)復(fù)合物的機(jī)械性能與松質(zhì)骨替代品類似。降解過(guò)程中抗壓5 MP，抗壓模量50 MPa48。復(fù)合骨替代材料可以以注射形式使用，這是臨床應(yīng)用中一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)。例如，羥基磷灰石 去端肽膠原復(fù)合

23、材料已被證明是適合骨質(zhì)的再生的先驅(qū)物質(zhì)49。 然而,盡管存在許多積極的結(jié)果，目前為止，大多數(shù)研究的結(jié)果顯示合并陶瓷相可提高生物活性，但是復(fù)合材料的力學(xué)性能不夠50。另一個(gè)明顯的缺點(diǎn)是，PCL基質(zhì)中的羥基磷灰石顆粒有向基質(zhì)表面遷移的傾向，并形成集群，最終形成不均一的支架51。骨組織工程的另一個(gè)基本組件是生長(zhǎng)因子的加入。BMP-2是一類蛋白質(zhì)的一個(gè)成員，TGF-s被視為是骨修復(fù)和再生最重要的調(diào)節(jié)因子。向支架中加入GFs的目的是創(chuàng)建一個(gè)成骨的微環(huán)境，且各種策略被用于控制GFs的釋放，例如水凝膠、直接加載、靜電相互作用和共價(jià)綁定等。合成支架目前組織工程應(yīng)用及生物材料方面已經(jīng)對(duì)多種多樣的合成聚合材料進(jìn)行

24、過(guò)相關(guān)研究。僅僅由可降解的聚合材料組成的支架已經(jīng)成功的在體內(nèi)應(yīng)用于輔助骨的再生 52。 聚合物的最大優(yōu)勢(shì)是親水性、降解率和機(jī)械性能等可以得到優(yōu)化。這些屬性可以以不同的方式來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，最常見(jiàn)的是通過(guò)共聚或引入不同的架構(gòu)。對(duì)聚合生物材料的降解程度和降解率的控制是至關(guān)重要的。 許多因素可影響材料的降解性，例如材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)、共聚物組成、體系結(jié)構(gòu)、分子量、形態(tài)、表面積和媒介特點(diǎn)?？山到饩酆衔锏母鞣N家族中，脂肪族聚酯是非常顯著的，因?yàn)樗饣蛎高B反應(yīng)可產(chǎn)生羥基酸。脂肪族聚酯可以通過(guò)功能酸和醇的縮聚合成，或環(huán)酯開(kāi)環(huán)聚合。丙交脂屬于羥基酸家族)，但其應(yīng)用卻有限，因?yàn)樗鞘杷?，沒(méi)有反應(yīng)鏈組。很難將藥物等活躍分

25、子和識(shí)別因子連接到這些和其他聚酯上：高疏水性有時(shí)會(huì)干擾針對(duì)性藥物的使用?？晌詹牧辖M成的支架在再生的過(guò)程中主要起臨時(shí)的支撐作用。 理想情況下，一旦受損組織充分再生，支架就應(yīng)開(kāi)始降解并失去其機(jī)械屬性。材料需要良好的力學(xué)性能來(lái)承受復(fù)雜的應(yīng)力，為此，晶體材料經(jīng)常受到使用。然而，晶體材料的一個(gè)潛在的缺點(diǎn)就是發(fā)生不良組織反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)：無(wú)定形聚合物較好，但他們的力學(xué)性能可能不足。在這種背景下，生物可降解嵌段共聚物成為良好的生物材料，因?yàn)槠鋬尚苑肿有袨椤C(jī)械和物理性質(zhì)可以通過(guò)調(diào)整構(gòu)成組分比例或添加所需的屬性的新的組分進(jìn)行調(diào)節(jié)。在這一領(lǐng)域的研究可以追溯到許多年前，有大量關(guān)于嵌段共聚物性質(zhì)的出版物。乳酸-乙醇酸共

26、聚物在一些研究中以顯示出良好的結(jié)果；然而，由于其相對(duì)較差的力學(xué)性能，其臨床應(yīng)用收到限制。聚乳酸和聚(乙二醇)的共聚物以多種方式改變其性能使自身達(dá)到優(yōu)化，以更適合醫(yī)療使用。研究已表明，調(diào)整共聚組分的長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)聚合物的結(jié)晶度，并且親水性比聚乳酸均聚物更好53。另一個(gè)有趣的系統(tǒng)是與對(duì)二氧環(huán)己酮共聚。 聚(1、5-dioxepan-2-one)(圖3)是一個(gè)無(wú)定形聚合物：柔軟、非晶相提供了彈性和理想的降解特性，而與聚乳酸的共聚物有嚴(yán)格的結(jié)晶相，它充當(dāng)一個(gè)物理交聯(lián)劑，提高了力學(xué)性能。研究表明,當(dāng)使用不同的單體成分時(shí)，聚合物的親水性發(fā)生變化54-55。在使用含有聚(1,5-dioxepan-2-one)

27、(DXO)的不同的體外細(xì)胞哦培養(yǎng)系統(tǒng)的一系列的實(shí)驗(yàn)中，這些聚合物有前景作為骨組織工程的支架材料 56-59。共聚作用也可用來(lái)解決很多脂肪族聚酯的一個(gè)缺點(diǎn)，那就是，沒(méi)有反應(yīng)位點(diǎn)。多個(gè)位點(diǎn)決定共聚合成的生物活性分子的選擇粘附60。合成骨替代物，復(fù)合移植物，聚合物都有巨大的潛力，如果精心設(shè)計(jì)可取得最理想的結(jié)果。微結(jié)構(gòu)和納米結(jié)構(gòu)支架的性能除選擇合適的組成成分外，微觀和納米結(jié)構(gòu)支架材料的性能也至關(guān)重要。表面性質(zhì),化學(xué)和質(zhì)地等顯著影響著細(xì)胞粘附和增殖，不僅決定細(xì)胞生存，信號(hào)，增長(zhǎng)，重組，還決定細(xì)胞表型和基因表達(dá)的情況。此外,支架必須要有開(kāi)孔，以允許細(xì)胞的長(zhǎng)入，甚至細(xì)胞在多孔結(jié)構(gòu)中的分布。 孔隙結(jié)構(gòu)同時(shí)也促

28、進(jìn)周圍組織新血管形成。 此外，支架應(yīng)該有足夠的微孔以允許毛細(xì)管長(zhǎng)入。然而，孔隙度同時(shí)影響支架其他重要屬性，如降解特點(diǎn)和機(jī)械穩(wěn)定性，考慮到被替代組織的力學(xué)要求，以上這些都應(yīng)該納入考慮的范疇。結(jié)論盡管材料科學(xué)技術(shù)已取得巨大的進(jìn)步，滿足骨和軟骨替代物所有要求的材料尚未開(kāi)發(fā)出來(lái)。為了修復(fù)的骨缺損，組織工程應(yīng)該把有成骨活性的細(xì)胞與一種適當(dāng)?shù)闹Ъ懿牧辖Y(jié)合起來(lái)，以刺激生理的骨再生和修復(fù)過(guò)程。源自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞具有多能性：根培養(yǎng)條件的不同，這種細(xì)胞具有分化為不同細(xì)胞類型的潛能，包括成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。 因此，間充質(zhì)干細(xì)胞有一個(gè)應(yīng)用于組織工程的現(xiàn)成的和豐富的細(xì)胞來(lái)源。缺乏免疫原性的MSC為在組織修復(fù)中使用這

29、些細(xì)胞開(kāi)辟了潛能。這些策略的目標(biāo)是利用人體的自然修復(fù)能力和新的骨細(xì)胞來(lái)修復(fù)損傷的骨頭。并且針對(duì)局部的壓力因素重塑新生骨組織。最佳生物材料支架的主要功能是支撐重建區(qū)域，提供足夠的初始機(jī)械力量。它還應(yīng)該能刺激該區(qū)域新骨形成，最后逐漸降解而不導(dǎo)致明顯的炎癥反應(yīng)，從而使新骨改建并承擔(dān)其機(jī)械支持的功能。在組織工程構(gòu)建中，選擇最合適的支架材料是至關(guān)重要的。比陶瓷更好的是基于聚酯和水凝膠生物可降解支架，它們通過(guò)化學(xué)修飾，從而具有可控制降解時(shí)間，并且容易加工成所需的孔形態(tài)的三維多孔結(jié)構(gòu)。組織工程也因以一個(gè)跨學(xué)科領(lǐng)域出現(xiàn)，它具有開(kāi)發(fā)和利用新材料的巨大的潛力，并應(yīng)用于前沿再生醫(yī)學(xué)和牙科學(xué)。 在這種背景下, 生物材

30、料在開(kāi)發(fā)組織工程器官方面發(fā)揮這至關(guān)重要的作用?？山到馍锊牧峡捎糜谥圃煅芑?、與機(jī)體骨骼相連接并維持細(xì)胞見(jiàn)相互靠近的三維構(gòu)造或支架，刺激新生骨的形成，并作為機(jī)體生物系統(tǒng)的一部分發(fā)揮作用。因此，材料的的制備（能夠提供適合的支架，并有助于細(xì)胞的粘附以及維持細(xì)胞的功能）對(duì)成功的骨再生具有機(jī)器重要的意義。為了滿足生物相容性的先決條件，以及未來(lái)功能需求的增加和特制的表面，許多研究工作努力都集中在表面改性，特別是功能和納米結(jié)構(gòu)的表面的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。每當(dāng)一個(gè)高分子生物材料的時(shí)候，其表面化學(xué)和結(jié)構(gòu)都非常重要，尤其是在植入的早期階段。植入物與機(jī)體組織之間的相互作用主要發(fā)生在支架的表面。因此，為了提高表面潤(rùn)濕性能，

31、強(qiáng)烈的需要一種可行的對(duì)聚合物進(jìn)行共價(jià)表面表面技術(shù)，從而規(guī)避當(dāng)前高分子生物材料的一個(gè)重要限制：它們具有疏水性。表面改性也可以使聚合物表面功能化，從而使生物活性物質(zhì)粘附在上面，并提高生物相容性。根據(jù)底物性質(zhì)的不同，可有幾鐘不同的技術(shù)來(lái)對(duì)合成和天然材料表面進(jìn)行共價(jià)修飾。間充質(zhì)干細(xì)胞與骨生成骨組織骨組織由骨基質(zhì)和骨細(xì)胞組成。骨基質(zhì)主要是由I型膠原蛋白(90%)構(gòu)建，剩下的10%是由大量非膠原蛋白組成 (如骨鈣素(OC)，骨粘連蛋白，骨涎蛋白，以及各種蛋白聚糖)。非膠原蛋白參與基質(zhì)的成熟過(guò)程、礦化，并且可能調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的功能活動(dòng)。骨細(xì)胞的兩分鐘主要類型已經(jīng)區(qū)別開(kāi)來(lái)。成骨細(xì)胞(骨形成細(xì)胞) ，破骨細(xì)胞(骨吸

32、收細(xì)胞)，聯(lián)合前體細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞 (如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞) 共同組成一個(gè)專門的單位，該單位被稱為骨多細(xì)胞單位。(類似于腎臟組織細(xì)胞形成腎單位)61。成人骨多細(xì)胞單位的主要功能是調(diào)解一個(gè)名為骨的“復(fù)興”機(jī)制，該機(jī)制被稱為骨的重塑，其目的在于通過(guò)移除高礦物質(zhì)密度的老骨骼來(lái)維持骨骼的完整性，并且通過(guò)反復(fù)周期性的骨吸收和骨形成來(lái)減少疲勞微骨折 61、62。在骨形成階段，成骨細(xì)胞來(lái)源骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞63。另一方面，破骨細(xì)胞是來(lái)源于造血干細(xì)胞（通過(guò)相應(yīng)的破骨細(xì)胞祖細(xì)胞融合形成成熟的多核細(xì)胞）64。因此，對(duì)于控制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化機(jī)制的理解是骨生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一。近來(lái)已經(jīng)認(rèn)識(shí)到MSC向非

33、成骨細(xì)胞分化的能力，在這里，我們?cè)噲D提供一個(gè)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞多分化潛能以及成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化之間關(guān)系的更新。成骨細(xì)胞的來(lái)源當(dāng)前對(duì)骨生物學(xué)的理解是，成熟的成骨細(xì)胞是從骨髓中的祖細(xì)胞分化而來(lái)的?；贔riedenstein和及其同事的先前工作65、66，骨髓中的非造血間隔（被稱為骨髓基質(zhì)）中含有一組具有成骨分化潛能的成纖維細(xì)胞樣干細(xì)胞 (被稱為間充質(zhì)細(xì)胞或骨髓基質(zhì)細(xì)胞或骨干細(xì)胞)。體內(nèi)這些細(xì)胞的確切位置尚不清楚，但是最近的研究表明，MSC位于血管周圍的空間，正如正如骨髓中內(nèi)皮下細(xì)胞圍繞血管竇一樣 67。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和特點(diǎn)由于間充干細(xì)胞質(zhì)相比造血干細(xì)胞更容易選擇性的粘附與塑料表面，已

34、經(jīng)從骨髓吸取物中的低密度單核碎片中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞68、71。然而以這種方式建立的培養(yǎng)物具有異質(zhì)性，里面既包含了干細(xì)胞，又包含了祖細(xì)胞群體。這已通過(guò)對(duì)MSC進(jìn)行克隆分析證明，其中只有少于 30%的克隆是真正的干細(xì)胞72、73。MSC的干性被定義為，在免疫缺陷SCID小鼠體內(nèi)的含有具有骨誘導(dǎo)能力的HA / TCP的植入物上面，這種克隆細(xì)胞可以形成異位骨和骨髓器官74。因此,將整個(gè)具有塑料粘附能力的MSC都定義為“干細(xì)胞”是不合適的。人類的MSC(hMSC)表型已經(jīng)通過(guò)許多CD標(biāo)記的表達(dá)確定。 hMSC沒(méi)有造血的表面標(biāo)記(CD34、CD45、CD14)，但是有STRO-1、CD29、CD73 、

35、CD90、CD105、CD106、CD166、CD146和CD4474 76。研究者已經(jīng)進(jìn)行過(guò)一些努力通過(guò)一種或多種這些特定的表面標(biāo)記的表達(dá)，來(lái)從間充質(zhì)干細(xì)胞分離均一的真正的干細(xì)胞。已經(jīng)嘗試過(guò)單獨(dú)用STRO-1或聯(lián)合CD106(VCAM-1)或CD146(MUC18)77，CD271(低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體)78，CD18(2整合素)79或胚胎干細(xì)胞標(biāo)記SSEA-480對(duì)真正的干細(xì)胞進(jìn)行分離。為了識(shí)別干性異常的表面標(biāo)記，已經(jīng)建立了一個(gè)全球質(zhì)膜蛋白質(zhì)組簽名 75。然而，為了達(dá)到對(duì)真正多能間充質(zhì)干細(xì)胞群體的預(yù)期的分離，仍有必要區(qū)別敏感和特定性的標(biāo)記。有趣的是，具有與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞相似生物學(xué)

36、特點(diǎn)的MSC已經(jīng)從其他來(lái)源（包括外周血81、臍帶血82、滑膜83、乳牙84、羊水85）中得到分離。這些不同的MSC有一些共同的屬性和表面表型，但具有不同的分化潛能，反應(yīng)組織起源的不同基因表達(dá)86。間充質(zhì)干細(xì)胞的體外成骨分化MSC在合適的體外條件下能分化中胚層細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞74、87。分化是通過(guò)增加如雞尾的形態(tài)因子及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為特定細(xì)胞重要的化學(xué)物質(zhì)引起的。例如，為了達(dá)到向成骨細(xì)胞分化，培養(yǎng)基中往往需要加入地塞米松、骨化三醇、抗壞血酸和-甘油磷酸鹽的混合物。在體外，分化是通過(guò)確定特定成骨基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)證明的。類似的方法也用于確定向其他細(xì)胞類型的分化。例如，幾個(gè)研

37、究人員通過(guò)使用地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤、胰島素和羅格列酮(過(guò)氧物酶體增殖激活受體2(PPAR-2)激動(dòng)劑) 作“雞尾酒(表示各種物質(zhì)相混合)”報(bào)告了hMSC向脂肪細(xì)胞分化的能力71、88、89。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)分化成骨人們?nèi)找嬲J(rèn)識(shí)到體外成骨細(xì)胞分化試驗(yàn)有局限性，因此有必要進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)以驗(yàn)證MSC的成骨細(xì)胞分化潛能。Friedenstein利用“擴(kuò)散室”來(lái)確定MSC的分化潛能66。利用載體(HA / TCP)在SCID小鼠的一個(gè)開(kāi)放的系統(tǒng)(皮下)異位植入間充質(zhì)干細(xì)胞在植入)已經(jīng)演變?yōu)榉治鯩SC成骨細(xì)胞分化和干性特征的“金標(biāo)準(zhǔn)”87、90、91。 在這種情況下，MSC可以形成骨和骨髓微環(huán)境支持

38、造血，而骨先質(zhì)細(xì)胞只能形成骨91。這鐘實(shí)驗(yàn)也被用來(lái)證明多能間充質(zhì)干細(xì)胞自我更新和在一系列植入實(shí)驗(yàn)中維持干性的能力。測(cè)試在體的培養(yǎng)MSC的表型的重要性通過(guò)體外鑒別人類間充質(zhì)干細(xì)胞（具有體內(nèi)成骨能力）體外克隆的價(jià)值有限得到證明 93。 在這項(xiàng)研究中，使用DNA 微陣列分析，一個(gè)MSC體內(nèi)成骨的預(yù)測(cè)性的分子分好被鑒別出來(lái)，該信號(hào)可為骨再生篩選一個(gè)具有較高體內(nèi)成骨能力的MSC集群93。控制人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的因素及通路為了確定對(duì)人類間充質(zhì)干細(xì)胞向特定系譜分化重要的因素和通路，研究者已經(jīng)使用了很多方法。利用遺傳學(xué)方法，為了誘導(dǎo)MSC分化，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種向特定系譜分化的轉(zhuǎn)錄因子。例如，核心結(jié)合因

39、子1(CBFA1 / Runx2；Runx-Runt相關(guān)因子)94，osterix95 (Osx)，脂蛋白相關(guān)受體5(Lrp5)96的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致成骨分化，然而PPAR-297和Sox998分別誘導(dǎo)形成脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞譜系?；蛘?，在微環(huán)境中，MSC暴露于生長(zhǎng)因子、激素及各種細(xì)胞外基質(zhì)成分的混合物中，從而誘導(dǎo)其分化。這些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了若干誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的因子，例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白99，Wnt100,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些抑制成骨分化的 因子，如Dlk1 / Pref-1101和Noggin102。我們使用了新穎的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法來(lái)識(shí)別決定MSC成骨細(xì)胞分化命運(yùn)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路103。一個(gè)被稱為細(xì)胞培

40、養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標(biāo)記的新開(kāi)發(fā)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法也用來(lái)比較磷酸酪氨酸信號(hào)通路（開(kāi)始于表皮生長(zhǎng)因子）與血小板源性生長(zhǎng)因子（不導(dǎo)致成骨分化）。 有趣的是，90%以上的信號(hào)蛋白被EGF和PDGF利用，而磷脂酰肌3激酶(PI3K)通路專門由PDGF激活，提示PI3K是一個(gè)可能的控制點(diǎn)。事實(shí)上，PDGF-刺激細(xì)胞中的PI3K化學(xué)抑制拯救了成骨細(xì)胞分化表型103。這些研究證實(shí)了先進(jìn)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)在識(shí)別藥理干預(yù)靶點(diǎn)的能力，從而控制控制MSC的分化。定義間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和成脂肪分化之間的關(guān)系最近的研究表明，骨質(zhì)和脂肪量密切相關(guān)，都受相同的激素調(diào)節(jié)，包括胰島素104，生長(zhǎng)激素105和以及近年來(lái)提出的瘦素10

41、6。大多數(shù)與骨質(zhì)流失相關(guān)的臨床條件（這些條件有老化、骨質(zhì)疏松癥、抗糖尿病藥物治療(噻唑烷二酮)和皮質(zhì)醇產(chǎn)生增加）都伴隨著骨髓脂肪細(xì)胞的增加。這歸因于間充質(zhì)干細(xì)胞分化由成骨細(xì)胞系傾向于脂肪細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化107、108。多方面的證據(jù)支持這個(gè)成骨與成脂肪關(guān)系的存在。在細(xì)胞水平上，骨髓MSC成骨和成脂肪分化之間存在相反的關(guān)系及表型存在可塑性。一些轉(zhuǎn)錄因子和通路已經(jīng)被證明可控制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞脂肪細(xì)胞分化之間的平衡，例如，有PDZ捆綁motif的轉(zhuǎn)錄共激活劑109，PPAR-2110，F(xiàn)osB111，經(jīng)典Wnt -連環(huán)蛋白以及非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路112。我們還報(bào)道，在高骨量的病人中，Wnt共受體，能

42、活躍突變的Lrp5 (T253I)以及Wnt激活并且由于上訴突變控制hMSC向成骨細(xì)胞分化和向脂肪細(xì)胞分化之間的較量 96。另一方面，骨髓脂肪細(xì)胞能分泌數(shù)種炎癥因子，包括瘦素、脂肪酶、脂聯(lián)素和抵抗素，并以旁分泌的方式抑制成骨細(xì)胞的分化及功能113、114。最近，李等 115首次提出證據(jù)證明骨可以作為一個(gè)內(nèi)分泌器官通過(guò)分泌的骨鈣素OC（成骨特異性蛋白）來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪代謝。OC作為一種激素原能夠減少脂肪量并促進(jìn)脂聯(lián)素（一種胰島素敏感脂肪因子）的表達(dá)115、116。這個(gè)新穎的發(fā)現(xiàn)通過(guò)分泌系統(tǒng)因子在骨形成和能量代謝之間建立了相互聯(lián)系。 在這種情況下，我們最近發(fā)現(xiàn)一種新穎的來(lái)源于前脂肪細(xì)胞的因子dl

43、k1 / FA1蛋白(like1 /胎兒抗原1)，它對(duì)于hMSC的成骨和成脂肪細(xì)胞分化皆有調(diào)節(jié)作用101。dlk1 / FA1是編碼一種跨膜蛋白的一種父系表達(dá)基因。在其細(xì)胞外的區(qū)域有六個(gè)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣的重復(fù)，這與Notch/Delta/Serrate家族的其他成員相似。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)FA1分子（在血液和組織液中循環(huán)）的細(xì)胞外區(qū)域在體內(nèi)以一種內(nèi)分泌的方式控制骨骼和脂肪的量117。 使用DNA微陣列技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)dlk1 / FA1通過(guò)MSC調(diào)節(jié)幾個(gè)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，因此可能通過(guò)控制微環(huán)境“利基”的組分來(lái)影響人類間充質(zhì)干細(xì)胞的分化118。因此，識(shí)別能夠調(diào)節(jié)骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞之間聯(lián)系的新穎的分泌

44、因子是一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，該領(lǐng)域能潛在性地導(dǎo)致增強(qiáng)骨形成治療靶點(diǎn)的識(shí)別。間充質(zhì)干細(xì)胞與性激素性激素，尤其是雌激素，在健康骨骼的發(fā)育和維持方面扮演著重要的角色119、120。但很清楚的是性類固醇不僅影響成熟分化的骨細(xì)胞，而且影響干細(xì)胞和不同階段祖細(xì)胞的行為 121。 植物雌激素木黃酮增強(qiáng)骨生成，壓制hMSCs分化形成脂肪細(xì)胞122。hMSC表達(dá)雌激素受體(ER)，同時(shí)也可能表達(dá)幾個(gè)ER -亞型122 125。有趣的是,成骨分化似乎會(huì)增加間充質(zhì)干細(xì)胞中所有Ers（ER-4亞型除外，它似乎主要在未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)）的mRNA的表達(dá) 122。MSC分化過(guò)程中ER概要的變化提示不同的系譜分化及階

45、段有不用的效應(yīng)及雌激素依賴的敏感性。ER基因多態(tài)性也可解釋對(duì)雌二醇刺激反應(yīng)個(gè)體間的差異性125。OC上調(diào)和鈣沉積的增加顯示17-雌二醇可增強(qiáng)人類間充質(zhì)干細(xì)胞劑量依賴性骨生成124。在其他研究方面，來(lái)自男性和女性捐贈(zèng)者的MSC都由雌二醇和睪酮刺激，雌二醇同時(shí)會(huì)增加鈣沉積，但只有從男性捐贈(zèng)者分離的細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)活性才增加125。另一方面，睪丸對(duì)于任何性別都對(duì)鈣沉積沒(méi)有影響。白藜蘆醇（一種多酚的植物雌激素）可能通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)通路增強(qiáng)hMSC的成骨細(xì)胞的成熟 126、127。最近的研究表明，hMSC可以表達(dá)幾個(gè)脫氫表雄酮向雌激素和睪丸激素胞內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶1

46、22、128、129。這表明hMSC在一定條件下可能制造所需的性激素或者使用血清脫氫表雄酮作為一種前體調(diào)整其水平，因此以胞內(nèi)分泌、自分泌或旁分泌的方式參與它們自身分化的過(guò)程，并參與骨骼中局部更復(fù)雜的性激素調(diào)節(jié)130。老齡化對(duì)成骨細(xì)胞生成的影響在老年人骨活檢中獲得的一個(gè)最一致的組織形態(tài)測(cè)量發(fā)現(xiàn)是松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的平均壁厚度都減小，提示在骨重建過(guò)程中，成骨細(xì)胞的成骨能力下降131。 平均壁厚取決于股形成初始階段所募集的成骨細(xì)胞及每個(gè)獨(dú)立骨細(xì)胞的成骨活性。最開(kāi)始獲得足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞是依賴于干細(xì)胞和祖細(xì)胞的可用性以及它們對(duì)骨微環(huán)境中生長(zhǎng)、分化和趨化信號(hào)的適當(dāng)反應(yīng)。成熟的成骨細(xì)胞基質(zhì)的產(chǎn)量及礦化功能取決

47、于成骨細(xì)胞對(duì)激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和離子（它們對(duì)完成這些過(guò)程是必須的）的可利用性。因此，與年齡相關(guān)的成骨細(xì)胞功能的損傷可以是干擾這些過(guò)程的任何機(jī)制導(dǎo)致的。 研究表明，MSC的數(shù)量變化不會(huì)隨著與衰老或骨質(zhì)疏松癥改變132，MSC在體外具有有限壽命，具有體外復(fù)制衰老表型的所有特點(diǎn)133。有趣的是，與年齡相關(guān)的 hMSC的最大壽命的下降已經(jīng)被觀察到，年輕人的人類間充質(zhì)干細(xì)胞有41±10集群倍增，而老年人有24±11個(gè)集群倍增 133。 除了MSC增殖隨著衰老損傷，研究同樣顯示衰老的微環(huán)境同樣影響間充質(zhì)干細(xì)胞的功能。由于人類間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老微環(huán)境經(jīng)歷了代理?xiàng)l件，來(lái)自年

48、輕的和老人的血清對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的功能收到了測(cè)試。對(duì)MSC功能進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試發(fā)現(xiàn)老化的血清抑制MSC的成骨分化和功能134。因此，MSC固有的老化和衰老微環(huán)境的負(fù)面影響可能是老年人體內(nèi)成骨細(xì)胞功能不全及骨形成缺陷的機(jī)制。MSC的衰老表型可以通過(guò)人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的超表達(dá)“拯救”135。 這樣拯救過(guò)的hMSC表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞增殖和體內(nèi)成骨能力135。調(diào)聚反應(yīng)同時(shí)也增強(qiáng)了一些成骨細(xì)胞的基因的表達(dá) 136。其他復(fù)蘇衰老MSC的方法需要被發(fā)現(xiàn)以起到其潛在的治療使用。結(jié)論在過(guò)去的十年里，收集了大量干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的機(jī)制的數(shù)據(jù)。 并期待將這些知識(shí)轉(zhuǎn)化為增強(qiáng)骨再生和骨形成的新方法，這是處理骨折和骨質(zhì)

49、疏松主要健康保健問(wèn)題的一個(gè)繼續(xù)解決的任務(wù)。胚胎、胎兒和成人干細(xì)胞在骨生成中的應(yīng)用細(xì)胞治療正在成為醫(yī)學(xué)療法修復(fù)、重建或改善組織功能的一個(gè)補(bǔ)充方法。血多細(xì)胞和組織類型已經(jīng)被提議作為起始材料，它們包括自體細(xì)胞，成體干細(xì)胞(包括具體組織、骨髓和脂肪MSC)， 胚胎干細(xì)胞,胎兒與胎爾細(xì)胞和胎盤組織和羊水137、143。有些細(xì)胞更適合于病人的細(xì)胞治療144。來(lái)自動(dòng)物和人類的各種類型組織在發(fā)育的各個(gè)階段都應(yīng)該評(píng)估其優(yōu)缺點(diǎn) (圖4)。胚胎、胎兒和成體干細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)是復(fù)雜的。法律上， “胚胎”這個(gè)術(shù)語(yǔ)表示卵子受精后的最早階段。 受精卵會(huì)通過(guò)細(xì)胞分裂至50到60個(gè)細(xì)胞階段產(chǎn)生早期胚胎分裂 (每個(gè)細(xì)胞的分裂球)，并在

50、受精后大約2周時(shí)間從60個(gè)細(xì)胞階段到達(dá)可供植入的階段。病理學(xué)將胚胎時(shí)期分為前9周的妊娠期和9周后到出生前之間的胎兒期。從不同的這些組織可建立不同的細(xì)胞系，但組織培養(yǎng)技術(shù)方面可遭遇不同的并發(fā)癥。胚胎干細(xì)胞是從胚胎發(fā)育的前面兩周的植入前胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)取得的。 這些細(xì)胞通常從額外部胚胎（通過(guò)體外受精幫助存在生殖問(wèn)題的夫婦形成的胚胎）獲取。自1975來(lái)對(duì)胚胎干細(xì)胞的使用存在停滯階段，直到1993年新法律出臺(tái)后才允許在某些特定情況下使用。因?yàn)檫@些特殊細(xì)胞的使用存在倫理方面的爭(zhēng)論，其他研究者已經(jīng)開(kāi)始使用自愿中斷5至8周懷孕的胚胎或胎兒細(xì)胞145。細(xì)胞系通常從胎兒的生殖嵴發(fā)育而來(lái)，但特定組織能從非成熟的組織

51、（其中需加入生長(zhǎng)因子以確保特定細(xì)胞的分化）中分離。大多數(shù)的胎兒細(xì)胞的研究是從在自愿終止懷孕的三個(gè)月后期(11 - 14周)使用特定組織的研究發(fā)展而來(lái)。這鐘組織(9周) 在大多數(shù)國(guó)家被認(rèn)為是器官捐贈(zèng)，它跨過(guò)了使用胚胎干細(xì)胞所引發(fā)的倫理道德問(wèn)題。細(xì)胞系在這個(gè)階段具有組織特異性，因此這些細(xì)胞被區(qū)別開(kāi)來(lái)，并具有特定的功能142、146 148。骨相關(guān)疾病的細(xì)胞治療第一個(gè)用于修復(fù)骨組織的基于細(xì)胞的策略是在同一個(gè)病人身上的髂骨部位取得的自體結(jié)締組織迅速的移植到需要骨修復(fù)的部位149、150。這個(gè)自體的過(guò)程不需要對(duì)組織進(jìn)行任何外部操作(如細(xì)胞分離、培養(yǎng)或擴(kuò)增)即可完成，因此被認(rèn)外科手術(shù)的一部分，并不作為一個(gè)

52、復(fù)雜的細(xì)胞療進(jìn)行調(diào)節(jié)。 如果需要做大量的操作，那么這個(gè)手術(shù)就稱為一個(gè)需要特殊調(diào)節(jié)的過(guò)程（需要一定的基礎(chǔ)設(shè)施以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)）。由于自體移植的生物學(xué)補(bǔ)充作用以及使用自體骨髓的低風(fēng)險(xiǎn)性，許多外科醫(yī)生都在使用自體移植策略。僅僅只有一小部分細(xì)胞能夠存活，并且只有103 或104 個(gè)細(xì)胞具有潛在的活性 151。骨髓移植的成功完全依賴移植足夠數(shù)量的祖細(xì)胞，因此這種方法在很多需要的情況下卻最少被利用，因?yàn)樗ダ虾图膊〕０殡S著健康的骨髓因子的減少，尤其是成骨的祖細(xì)胞。其它細(xì)胞來(lái)源因此受到重視， 特別正常的同種異體來(lái)源，這將會(huì)為骨修復(fù)策略提供直接可用的產(chǎn)品。其他成體干細(xì)胞（經(jīng)常被稱為MSC）為新的治療方法提供了希望

53、，因?yàn)樗麄冇泻芨叩淖晕腋履芰Γ⒛墚a(chǎn)生多個(gè)細(xì)胞譜系。他們不僅可以從骨髓中得到分離，而且可以從許多其它組織中分離（如羊水、脂肪組織、腦、皮膚、心臟、腎臟和肝臟）。盡管廣泛分布，成體干細(xì)胞僅僅代表組織細(xì)胞群體的一小部分(很多時(shí)候到個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞)，因此需要廣泛的體外分離和擴(kuò)增152。干細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)技術(shù)有一定的要求。未分化狀態(tài)下干細(xì)胞的維護(hù)和擴(kuò)增需要添加許多特定的GFs153。培養(yǎng)這些細(xì)胞而沒(méi)有滋養(yǎng)層通常由動(dòng)物細(xì)胞形成）是非常困難的，滋養(yǎng)層負(fù)責(zé)不一致克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，使用外源性GFs的必要性對(duì)于臨床使用干細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)是一種限制因素 138。胎兒細(xì)胞與干細(xì)胞不同，它們高度分化和再生，并具有低免疫

54、性能 154。他們可以從胎兒組織中分離（在胚胎發(fā)育周以后）。胎兒細(xì)胞具有著巨大的擴(kuò)增能力，并且相對(duì)干細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞類型，其細(xì)胞培養(yǎng)要求最小。由于胎兒細(xì)胞已經(jīng)分化，不需要指導(dǎo)或改變，正常情況下需要的對(duì)于這種額細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增不再必要146。細(xì)胞的選擇最具重要意義，為了給臨床試驗(yàn)產(chǎn)生安全的，一致的，成功的細(xì)胞治療，處理過(guò)程的每一個(gè)要素都需要特別的注意155。具有臨床使用有點(diǎn)的骨細(xì)胞所具備的具體特征整個(gè)骨髓移植在生物學(xué)上可能并不是最好的，骨髓骨母細(xì)胞的擴(kuò)增已經(jīng)受到評(píng)估。由于它們的分離和特征描述非常困難（由于它們?cè)谠M織中含量較低，缺乏具有特定反應(yīng)的抗體來(lái)確?；钚约?xì)胞成分的分離），所以這個(gè)程序是非常繁

55、瑣的。病人的治療只可能是在細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增4 - 6周之后。細(xì)胞功能的證明是特別重要的，所以分離細(xì)胞在體內(nèi)可以使基質(zhì)沉積、礦化骨化、結(jié)節(jié)形成和骨形成，而不需要纖維組織形成。盡管研究證明這些細(xì)胞能夠滿足所需的要求，對(duì)于每個(gè)病人使用這些方法是不可取的。最近，小于8周的胎兒股骨組織被用來(lái)提取骨先質(zhì)細(xì)胞，以進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而這些細(xì)胞群體可以被正式的成為胎兒干細(xì)胞(5 - 8周) 156。Mirmalek-Sani等人已經(jīng)證明組織學(xué)上比較像軟骨，并且已經(jīng)通過(guò)和使用來(lái)源于周妊娠期股骨的胎兒骨細(xì)胞群體的研究進(jìn)行比較證明其具有較高的可塑性證明。體內(nèi)8周干細(xì)胞的礦化是在具有骨誘導(dǎo)性的媒介中被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)于12 - 14周

56、胎兒骨細(xì)胞，這樣的媒體不是必要的，因?yàn)樽园l(fā)的礦化往往不需要外源性的GFs157。細(xì)胞自發(fā)的行為對(duì)于消除使用大量GFs的使用及增加生物安全是重要的，同時(shí)減少生產(chǎn)細(xì)胞的成本。使用具有較低可塑性的細(xì)胞是有力的，因?yàn)樗麄兿啾任捶只募?xì)胞更少依賴與環(huán)境因素（如營(yíng)養(yǎng)、機(jī)械負(fù)荷、炎癥、血管生成以及與內(nèi)源性細(xì)胞的相互作用）。此外，對(duì)12到14周的胎兒骨細(xì)胞在體內(nèi)的免疫學(xué)特性，安全和骨誘導(dǎo)性都進(jìn)行過(guò)廣泛的評(píng)估。Montjovent等人158證明，將poly-L-lactic酸和-TCP粒子組成的復(fù)合物作為支架來(lái)接種胎兒骨細(xì)胞能為成骨細(xì)胞提供合適的條件，從而因這些細(xì)胞較高的成骨潛能使其獲得完全的分化。而且，使用專

57、門的胎兒骨細(xì)胞庫(kù)和固體基質(zhì)的體內(nèi)研究顯示使用兩個(gè)不同的系統(tǒng)能夠顯著的促進(jìn)骨生長(zhǎng)158。使用羊的大型動(dòng)物模型進(jìn)行安全性研究表明來(lái)源于專門細(xì)胞庫(kù)的12周胎兒骨細(xì)胞在免疫學(xué)上可以接受，不形成纖維組織，促進(jìn)骨生長(zhǎng)的生物活性 (Applegate和Pioletti的個(gè)人溝通)。生物制劑治療的發(fā)展器官捐獻(xiàn)，適和良好生產(chǎn)流程的整個(gè)細(xì)胞生物處理和程序使通過(guò)測(cè)試為方便建立大量關(guān)鍵細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)提供了可能 (圖5)159。一旦關(guān)鍵細(xì)胞庫(kù)可以被生產(chǎn)，工作細(xì)胞庫(kù)也能生產(chǎn)來(lái)為大量病人(一個(gè)細(xì)胞庫(kù)中的成千上萬(wàn)個(gè))的治療建立獨(dú)立的批次。而且，進(jìn)一步對(duì)這些細(xì)胞庫(kù)的安全性進(jìn)行全面的測(cè)試（如不育病原體、機(jī)會(huì)性病原以及致腫瘤性

58、）。一旦安全性得到保障，通過(guò)具有生物相容性的傳遞系統(tǒng)承載的有效的細(xì)胞可進(jìn)行評(píng)價(jià)并用于特定的組織。對(duì)于細(xì)胞傳遞系統(tǒng)，必須要有可以利用的具有生物相容性的生物材料，從而為細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移和釋放提供細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞和材料應(yīng)該共同被測(cè)試以確定兩者不僅具有生物相容性，并且能相互作用，保持細(xì)胞穩(wěn)定性，復(fù)合物可能的降解副產(chǎn)品，降解或者吸收。最終產(chǎn)品緩和的適用性對(duì)臨床使用具有重要意義。為了醫(yī)藥產(chǎn)品和研究醫(yī)療產(chǎn)品能夠供人類使用，所有的細(xì)胞產(chǎn)品都必須良好生產(chǎn)規(guī)范的指南。對(duì)先進(jìn)治療醫(yī)療產(chǎn)品的歐盟監(jiān)管在2008年12月30日受到歐盟成員國(guó)的采納，并且美國(guó)食物藥品監(jiān)督管理局(FDA)最近提出了對(duì)人體細(xì)胞、組織和細(xì)胞產(chǎn)品和基于組織產(chǎn)品的規(guī)定160 164。這些法規(guī)的主要范圍是為許多新的細(xì)胞藥用產(chǎn)品建立清晰的分類標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)歐盟來(lái)說(shuō)，這借鑒了200