蛋白酶的固定化及其在生物活性物質(zhì)開發(fā)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

1、收稿日期:2007-11-28基金項目:國家科技攻關(guān)計劃重大專題項目(2006BAD04A08作者簡介:楊利花(1981-,女,碩士研究生,研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、生物活性物質(zhì)。E-mail :yanglihuahenan*通訊作者:陳慶森(1957-,男,教授,研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)。E-mail:chqsen蛋白酶的固定化及其在生物活性物質(zhì)開發(fā)中應(yīng)用的研究進(jìn)展楊利花,陳慶森*(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津300134摘要:從動植物蛋白中通過酶學(xué)方法釋放具生物活性的肽類物質(zhì)是目前酶工程研究的熱點課題。固定化酶技術(shù)是酶工程的核心技術(shù)之一,在生物科學(xué)研究

2、、生物產(chǎn)品的制造、食品科學(xué)、化學(xué)化工及環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。開發(fā)新型載體材料,設(shè)計簡單、方便、高效、條件溫和的固定化方法,是固定化酶技術(shù)研究的重點。本文結(jié)合自己的工作,重點介紹了殼聚糖材料、納米材料在固定化酶制備中的應(yīng)用,定向固定化方法研究進(jìn)展,蛋白酶的固定化及其在生物活性物質(zhì)開發(fā)方面的一些研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞:蛋白酶;殼聚糖;納米材料;定向固定;生物活性物質(zhì)RecentAdvancesinImmobilizationofProteaseandItsDevelopmentofBioactiveCompoundsYANGLi-hua,CHENQing-sen*(TianjinKeyLabora

3、toryofFoodBiotechnology,CollegeofBiotechnologyandFoodScience,TianjinUniversityofCommerce,Tianjin300134,ChinaAbstract :Itisahotresearchtopicinenzymeengineeringthatbioactivepeptidessubstancereleasingfromanimalandplant proteinbyenzymaticmethods.Immobilizedenzymetechniqueisoneofthecoretechnologiesofenzy

4、meengineering,whichis widelyappliedinthelifescience,bio-medicineproducts,foodscience,chemicalandenvironmentalscience,andsoon.Thefocus ofimmobilizedenzymetechniqueistodevelopnewcarriermaterialsanddesignsimple,convenient,extremelyefficient,mild conditionsoftheimmobilizedmethod.Basedonourresearch,thisp

5、apermainlysummarizedthecarriermaterialssuchas chitosanandnanostructures,andtechnologiesofimmobilizedenzymesuchasorientedimmobilization,andresearchadvancein immobilizationofproteaseanditsdevelopmentofbioactivecomponents.Keywords :protease ;chitosan ;nanostructures ;orientedimmobilization ;bioactiveco

6、mponents中圖分類號:Q814.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:1002-6630(200802-0466-06從20世紀(jì)下半葉開始許多學(xué)者致力于固定化酶在各個領(lǐng)域的應(yīng)用研究。與游離酶相比固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時又克服了游離酶的不足之處,呈現(xiàn)儲存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等優(yōu)點。固定化酶的研究在化學(xué)、生物學(xué)、生物工程醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域異?；钴S,其主要應(yīng)于以下四個方面:第一,用于分析和醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面;第二,用于提純蛋白質(zhì)和酶;第三,固相蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基本手段;第四,控制蛋白質(zhì)藥物的釋放。然而,檢索大量的國內(nèi)外的文獻(xiàn)表明僅有少量的

7、固定化酶應(yīng)用于實際生產(chǎn),目前選擇合適的載體和簡單易行的固定化方法并使其規(guī)?；允枪潭ɑ讣毙杞鉀Q的問題。固定化酶履行兩種功能:非催化功能,用于幫助分離(如從應(yīng)用微環(huán)境中分離催化劑,重復(fù)使用催化劑,特別用于控制加工過程;催化功能,在特定的時間和空間內(nèi)轉(zhuǎn)化目標(biāo)產(chǎn)物。固定化酶的主要任務(wù)就是選擇合適的載體(即固定化酶的非催化部分,催化部分構(gòu)建的位置、操作條件(pH 值、溫度和介質(zhì)的性質(zhì)和酶(來源、性質(zhì)和純度來設(shè)計固定化催化劑。固定化方法的選擇既要滿足催化功能的需要(特別在產(chǎn)量、效率、穩(wěn)定性和可選擇性方面的需要也要滿足非催化功能的需要(如分離、控制加工過程、下游處理的需要,只有催化功能和非催化功能都滿足

8、特殊應(yīng)用的需要時該固定化酶才可以稱為“高效”的。高效的固定化酶可以監(jiān)控反應(yīng)過程而且可以大大降低成本,但是缺乏對選擇固定化方法的指導(dǎo)方針以及對固定化酶應(yīng)用在加工中可能出現(xiàn)的未知情況的預(yù)料會嚴(yán)重妨礙了設(shè)計高效固定化酶的發(fā)展。本文重點從固定化酶載體材料、幾種具有很好發(fā)展前景的固定化酶制備技術(shù)以及利用固定化酶技術(shù)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)方面進(jìn)行了比較和較為系統(tǒng)的綜述。1載體材料開發(fā)的研究進(jìn)展載體材料作為固定化酶的一部分,其結(jié)構(gòu)特性對固定化酶的各種性能都有著巨大的影響,因此自固定化酶技術(shù)興起以來很多學(xué)者就一直致力于對載體的研究。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展無機(jī)材料、天然高分子材料、合成高分子材料以及復(fù)合材料等先后用于固定

9、化酶載體材料的研究。下面重點介紹殼聚糖材料、納米材料在固定化酶研究中的應(yīng)用進(jìn)展。1.1殼聚糖材料殼聚糖材料是地球上存在的及其豐富的天然高分子材料,其含量僅次于纖維素是唯一的一種天然堿性多糖,其來源廣泛是世界上產(chǎn)量最豐富的、可再生的有機(jī)資源之一,因此殼聚糖材料是令人感興趣的一類適合工業(yè)需要的固定化酶載體材料。殼聚糖作為酶固定載體有獨特的生化性質(zhì):無毒性、良好的凝膠特性、獨特的生物兼容性、降解產(chǎn)物的無毒性、生理惰性、顯著的蛋白質(zhì)親和性、金屬離子螯合性等1。目前,殼聚糖材料尚未得到充分的開發(fā)利用,與其它一些酶的固定化載體相比,具有廣泛的開發(fā)前景。GamzeDA等用乙二醛為交聯(lián)劑制備殼聚糖球載體固定化

10、胃蛋白酶2。該方法制備的殼聚糖珠,克服了長時間在酸性條件下殼聚糖顆粒融解的問題,與溶液酶相比熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性有很大程度的提高,由牛奶凝乳試驗證明固定化胃蛋白酶可用于實際生產(chǎn)。TangZX 等用離子凝膠法制備殼聚糖顆粒,用于固定化中性蛋白酶的研究3。酶固定在殼聚糖顆粒上之后,熱穩(wěn)定性,操作穩(wěn)定性,以及儲藏穩(wěn)定性都大大提高了。XiFN 等用殼聚糖-聚乙二醇(PEG2000包埋硅膠制備多孔載體固定胰蛋白酶,分別以環(huán)氧試劑,重氮試劑,戊二醛等活化載體制備固定化酶4。實驗結(jié)果表明,重氮化作用得到的固定化酶活性回收率最高。固定化酶的穩(wěn)定性比溶液酶明顯提高,溶液酶和固定化酶的最適溫度都在40左右,重氮化

11、作用制備的固定化酶最適溫度60。本實驗室開展了以殼聚糖為載體固定化胰蛋白酶的研究。探索了載體制備方法,具體方法為:殼聚糖2.5g 于99ml去離子水中磁力攪拌10min,加1ml乙酸,室溫攪拌3h,4過夜。將殼聚糖溶液逐滴滴入凝結(jié)液,凝結(jié)3h,殼聚糖將凝聚成白色顆粒,用去離子水充分洗滌至中性備用。分別研究了4%N a O H溶液和乙酸乙酯(體積比為20:1混合溶液;4%NaOH溶液和甲醇(體積比為3:1混合溶液;20mg/ml三聚磷酸鈉溶液;15%NaOH 溶液和95%乙醇(體積比為4:1混合溶液四種凝結(jié)液對殼聚糖凝膠成球性的影響,結(jié)果表明以15%NaOH溶液和95%乙醇(體積比4:1為凝結(jié)液

12、制備的殼聚糖顆粒載酶量以及固定化酶活力比其他三種凝結(jié)液制備的載體都高,進(jìn)一步研究了該載體固定化胰蛋白酶最佳條件,載體經(jīng)0.5%戊二醛活化2h,加一定量pH7.0Tris-HCl緩沖液, 7mg/ml胰蛋白酶溶液10條件下振蕩固定化18h,載酶量達(dá)到30.72mg/g濕載體,固定化酶活力472.39U/g(以酪蛋白為底物,pH8.0Tris-HCl緩沖液40,1min內(nèi)產(chǎn)生1g酪氨酸的酶量為一個活力單位。殼聚糖與粘土、活性炭等天然吸附類材料耦合制備凝膠可以克服單一殼聚糖凝膠密度小易漂浮于底物表面,影響傳質(zhì)的缺點,且能增大凝膠機(jī)械強(qiáng)度使結(jié)構(gòu)更加緊密有序。ChangMY等研究了以殼聚糖和粘土的復(fù)合物

13、固定化-葡萄糖苷酶,有效地提高了酶的熱穩(wěn)定性和酶活5。具體方法如下:等量的殼聚糖和活性泥混勻,用1%的乙酸配成2%的膠體,用注射器以恒定速度滴到15%NaOH和95%乙醇混合溶液(體積比為4:1中交聯(lián)1d,去離子水反復(fù)沖洗之至中性得固定化載體。利用此方法分別研究了以濕態(tài)殼聚糖復(fù)合物和冷凍干燥后殼聚糖復(fù)合物以及純殼聚糖為載體,用戊二醛活化固定化酶。試驗結(jié)果表明固定化酶的儲藏穩(wěn)定性比游離酶提高了許多,重復(fù)使用50次后,干燥的復(fù)合載體固定化酶的活性比其他兩種載體固定化酶的活力高。在載體材料中滲入特定粒子以增加其密度或賦予磁性,將有利于改善其傳質(zhì)、吸附及分離性能。JiangD S等將殼聚糖與磁性F e

14、3O4納米粒子耦合應(yīng)用,用反相懸浮法制得殼聚糖磁性微球,以戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化漆酶,制得的小球顆粒形態(tài)完好,顆粒均勻,平均直徑為0.5m,制得的固定化漆酶的熱穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性大大提高6。任廣智等做了磁性殼聚糖載體吸附法固定化脲酶的研究,結(jié)果表明磁性殼聚糖對脲酶的固載量與磁性殼聚糖微球的粒徑交聯(lián)度及酶溶液的離子強(qiáng)度成反比7。1.2納米材料納米材料是指具有納米量級的超微粒構(gòu)成的固體物質(zhì)。納米材料具有三個結(jié)構(gòu)特點:結(jié)構(gòu)單元或特征維度尺寸在納米數(shù)量級(1100nm;存在大量的界面或自由表面;各納米單元之間存在一定的相互作用。由于納米材料結(jié)構(gòu)上的特殊性,用納米材料作固定化酶載體具有一些

15、獨特的優(yōu)點:提供較大的比表面積,可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小設(shè)計合適的孔徑,具有較大的負(fù)載量,最大程度降低酶分子和底物之間的擴(kuò)散限制阻力。JungbaeK等闡述了納米材料在固定化酶,以及提高酶的穩(wěn)定性方面的最新進(jìn)展,指出納米技術(shù)的發(fā)展和納米材料的開發(fā)為固定化酶的發(fā)展以及提高酶穩(wěn)定性提供了新的機(jī)會8。近年來納米技術(shù)取得突破性進(jìn)展,開發(fā)出各種各樣的納米材料滿足納米材料在各領(lǐng)域應(yīng)用需要。盡管納米材料作為固定化酶載體材料的研究還處于探索階段,通過各種方法包括吸附法、共價結(jié)合法、包埋法、以及各種傳統(tǒng)方法的綜合運用將酶固定在納米載體的研究已有報道。納米材料從形態(tài)結(jié)構(gòu)上可分為:納米顆粒、納米纖維、多孔納米材料和

16、單分子納米酶顆粒四類。1.2.1納米顆粒JiaH等指出納米顆粒在溶液中獨特的性質(zhì),在均相和異相的中間態(tài)催化作用值得關(guān)注9。顆粒大小以及溶液粘度決定顆粒在溶液中的靈活性,理論和試驗研究證明顆粒的靈活性影響顆粒狀固定化酶的活性。1.2.2納米纖維Kim等以戊二醛為交聯(lián)劑,將-胰凝乳酶聚集體固定在電鍍聚苯乙烯納米纖維表面,酶負(fù)載量比共價法高9倍多10。固定化酶操作穩(wěn)定性極好,在連續(xù)一個月振蕩條件下檢測沒有活性損失。這種方法將酶固定在納米纖維上,酶的穩(wěn)定性,酶活回收率大大提高,為酶在生物醫(yī)藥,生物傳感器等領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用提供了可能。1.2.3多孔納米材料自1992年Mobil課題組開發(fā)出多具有高比表面

17、積、高孔體積、以及有序孔道的多孔材料MCM-41以來,納米材料中孔徑大小為250nm的介孔分子篩等多孔硅酸鹽材料作為生物催化劑載體的備選材料之引起了廣泛關(guān)注。Diaz和Balkus第一次報道了將酶固定在介孔分子篩MCM-41,發(fā)現(xiàn)固定化酶的效果取決于酶分子的大小11。尤其是大分子酶如山葵過氧化物酶(直徑為4.6n m固定在M C M-41(孔徑4n m載體上,固定化效率很低。但是M C M-型載體固定化小分子酶取得了很好的結(jié)果。隨后,SBA-15(孔徑為513nm和MCF-型(孔徑為15 40nm材料的出現(xiàn)解決了MCM-41載體不能固定化大分子酶的問題。Deere等詳細(xì)研究了用多孔硅酸鹽固定化

18、細(xì)胞色素C,研究表明只有多孔硅酸鹽的孔徑大于蛋白分子直徑,并且多孔硅酸鹽表面經(jīng)充分改性之后,才能達(dá)到很好的吸附效果12。Yiu等研究了將胰蛋白酶吸附在M C M-41,M C M-48,S B A-15等具有納米級孔徑載體上,其研究結(jié)果表明多孔材料表面的功能基團(tuán)對固定化效果起關(guān)鍵作用,載體載酶量的高低取決于載體孔徑和酶分子直徑大小13。近幾年的研究趨勢是通過更精密的方法修飾多孔硅酸鹽材料,擴(kuò)大入口孔徑尺寸或者改變孔徑結(jié)構(gòu)而是酶分子迅速固定在多孔材料上。用多孔材料固定化酶已應(yīng)用于生物傳感器,多肽合成,紙漿漂白等方面,相信在不久的將來會有越來越多的固定化酶在不同領(lǐng)域的應(yīng)用被報道。1.2.4單分子納

19、米酶顆粒Kim等報道了一種納米酶復(fù)合物顆粒(SENs,是提高酶穩(wěn)定性方面的一個創(chuàng)新14。SENs的合成方法:首先乙烯基通過共價修飾酶分子表面的賴氨酸殘基,用烯丙酰氯連接到酶分子表面,在酶分子表面形成線性聚合體;其次把與酶分子共價結(jié)合的聚合體置于水相中,線性聚合體在水相中水解并相互聚合,從而在每個酶分子間形成有機(jī)或無機(jī)復(fù)合物網(wǎng)格(圖1。嚴(yán)格控制反應(yīng)條件,使交聯(lián)反應(yīng)只在酶分子表面發(fā)生,產(chǎn)生離散的納米酶顆粒,而不是包埋聚合酶(圖2。以蛋白酶為模型制備納米酶顆粒S E N s,產(chǎn)率達(dá)38%73%,這一結(jié)果表明采用SENs的形式固定化酶在更多領(lǐng)域里應(yīng)用是可行的。在S E N s獨特結(jié)構(gòu)中,酶分子通過多點

20、共價結(jié)合置于三維聚合網(wǎng)格中,網(wǎng)格的厚度僅幾納米,使底物和酶分子的活性位點能夠充分接觸,沒有傳質(zhì)障礙。固定化胰凝乳蛋白酶S E N-C T ,和游離胰凝乳蛋白酶相分酶表面共價修飾表面聚合物成長形成相互交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)單分子納米酶顆粒圖1單分子納米酶顆粒合成示意圖Fig.1 Schematic for SEN synthesis圖2單分子酶顆粒與包埋法固定化酶的示意圖Fig.2 Schematic comparison of SEN approach with enzyme modification and encapsulation approaches酶單分子納米酶顆粒(SENs修飾酶包埋酶別置于3

21、0緩沖液中,游離酶2d內(nèi)迅速自溶,而固定化酶活性6d內(nèi)基本不變。4條件下保存五個月固定化酶的活力基本不變。動力學(xué)研究表明,酶分子表面的納米級網(wǎng)格對酶與底物的傳質(zhì)沒有明顯影響。S E N s是一種活性和穩(wěn)定性都很高的酶的形式,由于S E N s顆粒僅幾納米大小,因此可進(jìn)一步固定在多孔材料上,預(yù)計聯(lián)合SENs(活性和穩(wěn)定性極高的酶和多孔材料(提供大表面積和可調(diào)孔徑的載體可制備出理想的酶反應(yīng)器,應(yīng)用于生物制藥,生物傳感器和其他生物催化過程。2蛋白酶固定化方法的研究進(jìn)展2.1傳統(tǒng)固定化技術(shù)的改進(jìn)方法傳統(tǒng)固定化包括吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法四種方法。對傳統(tǒng)固定化方法的部分改進(jìn)能提高固定化酶的活力

22、,如將戊二醛的一端用二乙醇胺保護(hù)后活化載體,再脫保護(hù)并用于酶的固定化,避免了載體或酶的自身交聯(lián)反應(yīng),從而可以較大幅度地提高固定化酶的酶活力回收15。利用空間懸臂技術(shù)將減小酶促反應(yīng)及固定化酶時的空間阻礙而提高固定化酶的活性,如采用不同鏈長的二元胺等交聯(lián)劑活化聚氯乙烯及聚丙烯酸甲酯等大孔球狀載體時,固定化酶的活力隨著側(cè)基的鏈長增加而提高。MeryemN等研究了將胰蛋白酶分別通過聚乙二醇二胺(PEG-diamine、葡聚糖醛、葡聚糖氨牛血清白蛋白固定在合成高分子材料聚酯上與直接將胰蛋白酶固定在聚酯上,證實了通過長臂可以將生物分子有效定向固定在固體介質(zhì)上,有效減小由于介質(zhì)表面特性引起的立體位阻和空間環(huán)

23、境的影響16。此外,對傳統(tǒng)固定化方法的聯(lián)合使用是設(shè)計高效合理固定化酶的發(fā)展趨勢。2.2定向固定法定向固定法即通過不同的方法,把酶和載體在酶的特定位點連接起來,使酶在載體表面按一定的方向排列,使它的活性位點面朝載體表面的外側(cè)排列。傳統(tǒng)的固定化方法隨機(jī)固定化(randomimmobilization常導(dǎo)致酶活力下降,這主要是因為酶蛋白常常通過賴氨酸殘基上的-氨基與載體活性基團(tuán)偶合,酶表面分布有多個賴氨酸殘基,與載體作用時可以采取多種空間取向,酶蛋白多點附著在載體上,結(jié)構(gòu)發(fā)生了變異,增加了底物接近酶活性中心時的空間位阻,使酶活力下降,同時,多位點結(jié)合也會降低固定化酶的載酶量。由于酶的定向固定化具有容

24、量大、活性高的優(yōu)點,將成為今后固定化酶方法研究的一大熱點17。JaroslavaT、邵文海、曹黎明等先后對定向固定化方法做了綜述,據(jù)報道定向固定化酶的方法有:氨基酸置換法、抗體偶聯(lián)法、生物素-親和法、疏水定向固定法、酶和金屬離子連接法、共價固定法等18-20。Huang等通過定點突變在枯草蛋白酶(subtil-isin分子表面遠(yuǎn)離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys殘基21。經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys,利用Cys殘基上的巰基固定枯草蛋白酶分子,取得了較好的固定效果。定點突變用于定向固定要求對蛋白質(zhì)的核酸序列及空間結(jié)構(gòu)有充分了解,蛋白質(zhì)分子表面不含所要引入的氨基酸殘基,而且引入的氨基酸不能影響

25、蛋白質(zhì)分子的正常空間折疊及構(gòu)象改變。Viswanath等用特定位點基因突變法實現(xiàn)定向固定化酶22。如果酶中沒有半胱氨酸或酶的活性位點中沒有半胱氨酸,可以在酶的特定位點上通過基因突變引入特殊半胱氨酸,例如將絲氨酸變?yōu)榘腚装彼?一般對于這個半胱氨酸,酶可以通過引入的半胱氨酸的一側(cè)的巰基和載體表面的親巰基團(tuán)反應(yīng),從而使酶和載體在特定位點進(jìn)行固定化?？莶輻U菌蛋白酶(subtilisin沒有半胱氨酸,而且在遠(yuǎn)離活性位點的位置存在絲氨酸,可以通過基因突變法用-SH替代-OH,把絲氨酸變異為半胱氨酸,通過動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)變異后的酶的活性與水溶液中的酶的活性并沒有太大的區(qū)別,說明這種變異對酶的功能沒有影響。Sp

26、itznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠,定點固定抗體酶48G7-4A1的Fab片段用于反應(yīng)動力學(xué)研究23; B1lkovaZ等以無孔羥烷基甲基丙稀酸酯固體為載體,通過固定異凝乳蛋白酶的多克隆抗體定向固定胰凝乳酶,載體的負(fù)載量達(dá)166.7g/g,固定化胰凝乳酶的回收率達(dá)到100%,固定化酶分子的有序排列,使活性中心充分暴露,使大分子底物易于接近酶活性中心,固定之后酶的動力學(xué)參數(shù)有所提高24。LesaicherreML等分別通過生物素和其抗體之間的親和作用、硫酯和N末端含半胱氨酸的通過化學(xué)連接反應(yīng)實現(xiàn)縮氨酸在玻璃載體表面的定向固定25。金屬離子螯合親和層析(immobilizedmetalion

27、affinity chromatography,IMAC技術(shù)利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)表面的供電子氨基酸-組氨酸的咪唑基,胱氨酸的巰醇基等(其中以組氨酸最為重要以配位作用緊密結(jié)合的原理,從而對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化26。金屬螯合載體對固定到表面的蛋白質(zhì)構(gòu)象影響小,這種技術(shù)可應(yīng)用于定向固定化酶。GuptaP等利用該技術(shù)將菠蘿蛋白酶定向固定在金屬螯合載體瓊脂糖6B-亞氨基二乙酸(IDA-C u2+上,固定化酶的回收率、穩(wěn)定性、操作穩(wěn)定性大大提高27。劉琳琳等利用金屬螯合配體與蛋白質(zhì)相結(jié)合的原理,選用磁性瓊脂糖-亞氨基二乙酸(IDA-Cu2+做為金屬螯合載體,定向固定了木瓜蛋白酶,并對固定化條件和酶學(xué)參

28、數(shù)進(jìn)行了深入研究,為這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于固定化酶奠定了基礎(chǔ)28。3固定化蛋白酶在生物活性物質(zhì)開發(fā)中應(yīng)用的研究進(jìn)展采用酶解的方法生產(chǎn)生物活性肽,一方面可以生產(chǎn)大量的小肽而且造價低廉,另一方面反應(yīng)底物、反應(yīng)劑和反應(yīng)環(huán)境沒有危害。目前最基本的方法是使用蛋白酶進(jìn)行簡單的水解,此種方法不僅可制取具有功能性的食品蛋白而且不會損壞其營養(yǎng)價值。除可釋放出各種為人類所需要的生物活性肽之外,將食物降解為不同長度的肽還可以使其更加容易消化。酶解蛋白法制備生物活性肽工藝中,游離酶的不穩(wěn)定性以及成本高一直制約著酶解制備活性肽的大規(guī)模生產(chǎn)。利用固定化蛋白酶制備生物活性肽,能克服游離酶穩(wěn)定性差、分離回收困難等缺點,而且可以大

29、大降低成本。目前酶解蛋白制備活性物質(zhì)的研究用游離酶的居多,而用固定化酶酶解的報道不多,其重點研究對象集中在大豆蛋白、酪蛋白等。大豆蛋白方面,武軍等應(yīng)用固定化堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白,并對制備大豆肽的工藝條件進(jìn)行正交試驗,制得的大豆肽的水解度為39.20%,可溶性蛋白溶解指數(shù)為0.995729。曹玉華等先后研究了固定化木瓜蛋白酶、固定化胰蛋白酶、以及雙固定化酶水解大豆分離蛋白,對水解大豆分離蛋白制備大豆肽的工藝條件進(jìn)行研究,在最佳條件下酶解液中可溶性蛋白含量為1.384mg/ml,水解度43.65%以上;其中雙固定化酶所得豆肽的含量、水解度比單酶均有所提高,并且有效降解大豆肽的分子量,為大豆肽

30、的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)30-32。大豆多肽無論是理化特性、營養(yǎng)特性還是功能特性都優(yōu)于大豆蛋白質(zhì),有廣泛的應(yīng)用前景和巨大的市場潛力。酪蛋白方面,ToldraF等成功地將從豬腎組織中提取的組織蛋白酶B固定在多孔玻璃珠上,用于水解酪蛋白,研究發(fā)現(xiàn)-酪蛋白在24h內(nèi)迅速降解為分子量19. 532kD的多肽片斷,-酪蛋白在2448h內(nèi)降解,最終水解產(chǎn)物的分子量為1821kD,固定化酶得到的水解產(chǎn)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離酶,因此這種反應(yīng)器可以用于從酪蛋白水解產(chǎn)物中釋放特定分子量大小的肽33。WangJJ 等做了固定化角蛋白酶的研究,并用固定化角蛋白酶部分水解角蛋白、-酪蛋白,制備了分子量分別為12、6、2kD的多

31、肽,分子量小于10kD的短肽很難用尺寸排除柱法分離,用固定化角蛋白酶水解角蛋白和酪蛋白,為制備分離短肽提供了可能34。陳慶森等報道了以殼聚糖為載體固定堿性蛋白酶制備酪蛋白磷酸肽(CPPs的方法35。國內(nèi)外大量研究證實,CPP可以促進(jìn)鈣的吸收且不需要V D的參與,同時能夠阻止鈣鹽結(jié)晶,從而提高鈣離子在小腸下段的濃度,提高了鈣的吸收率。利用固定化酶技術(shù),研究和制備高活性、高穩(wěn)定性、高機(jī)械強(qiáng)度的固定化蛋白酶,生產(chǎn)物美價廉的CPP解決鈣吸收率低的補鈣難題。陳芳艷等研究了以絲素固定化木瓜蛋白酶填充床反應(yīng)器,用以降解酪蛋白并研究了該反應(yīng)器的試驗條件、操作參數(shù)及對酪蛋白的降解能力,結(jié)果表明:在恒溫30,恒定

32、流速5.5ml/h,酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的條件下,該填充床反應(yīng)器的生產(chǎn)強(qiáng)度最高達(dá)1. 42g/Lh;產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率在213d內(nèi)均能達(dá)到87.4%99. 9%;對酪蛋白的降解能力良好36。其他方面,葉蘊華等首次通過將蛋白酶吸附固定在微孔分子篩MCM-22上,在有機(jī)溶劑中通過3+2路線合成了生物活性五肽前驅(qū)體OGP-(10-14,Z-Tyr-Gly-Phe-Gly-OEt和腦啡肽片段,同自由酶相比固定化蛋白酶的催化反應(yīng)速率和收率在多數(shù)情況下均有較大提高37。PedrocheJ等利用瓊脂糖固定化胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶-A對蕓苔蛋白進(jìn)行連續(xù)水解,最終水解度達(dá)到36%,水解產(chǎn)物主要為分子量小于1

33、5kD的短肽38。研究發(fā)現(xiàn)蕓苔蛋白水解產(chǎn)物特別是分子量在18001400D 的短肽和蕓苔蛋白相比具有顯著的抗氧化活性和ACE酶抑制活性,這一研究成果對利用固定化酶水解植物蛋白釋放活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究具有重要的啟迪意義。Ticu EL等用2-乙醇胺-O-磷酸處理氧化鋁為載體固定化胃蛋白酶,設(shè)計連續(xù)攪拌斧反應(yīng)器并用于胃蛋白酶酶促水解血紅蛋白,連續(xù)收集水解產(chǎn)物中具有鎮(zhèn)痛功能的肽(LVVh-7,7-VVh和抗菌肽(1-2339。這種肽只有富集到一定濃度才有活性并且容易失活,所以需要及時收集。利用固定化酶反應(yīng)器為大量制備這種肽提供了可能。近年來生物活性肽的研究領(lǐng)域發(fā)展很快,研究者也不僅僅局限于大豆蛋白、

34、酪蛋白,紛紛對一些資源豐富的蛋白質(zhì)資源開展了相關(guān)研究,如谷物蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、淡水魚蛋白和海洋蛋白等的研究與開發(fā)40-42。相信隨著生物技術(shù)、固定化技術(shù)的發(fā)展,固定化酶將應(yīng)用于大量生物活性物質(zhì)開發(fā),從而應(yīng)用于功能性食品、嬰兒食品、食品添加劑、藥品、化妝品、無公害飼料添加劑等方面生產(chǎn)。4展望蛋白水解產(chǎn)物中的活性肽類作為功能性食品的成分,已經(jīng)引起藥學(xué)和食品工業(yè)上相關(guān)人士的廣泛興趣。國內(nèi)外許多學(xué)者致力于從動植物蛋白中釋放活性肽的研究,已經(jīng)從酪蛋白、血紅蛋白、金槍魚肉蛋白、卵清蛋白、麥胚蛋白等的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了大量的活性肽。制備蛋白質(zhì)高水解度的水解產(chǎn)物以及特定長度的肽段,需要反應(yīng)速率可控的反應(yīng)

35、器來實現(xiàn)。目前在我國固定化酶制劑成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)很少,因此固定化酶的研究開發(fā)任重道遠(yuǎn)。國內(nèi)外的大量研究證實,固定化酶技術(shù)目前尚存在酶活回收率低、固定化效率不高等問題,阻礙固定化酶在工業(yè)中大規(guī)模使用;所以探索酶定向固定化技術(shù);新型載體如超臨界技術(shù)、納米技術(shù)、膜技術(shù)等在專題論述 食品科學(xué) 20 21 2008, Vol. 29, No. 02 471 固定化酶技術(shù)方面的應(yīng)用,將是固定化酶技術(shù)的方向. 另外,開發(fā)新型,高效固定化酶反應(yīng)器,使固定化酶 技術(shù)的裝備模擬生物體的環(huán)境,實現(xiàn)發(fā)酵過程人工智能 優(yōu)化與控制,使體外生物反應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮出更大的作用. 曹黎明, 陳歡林. 酶的定向固定化方法及其對酶生物

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