基因相關(guān)名詞解釋

1、名詞解釋一、生物學(xué)名稱解釋1. 什么是高通量測序技術(shù)？高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS）是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的改變, 一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。2. 什么是Sanger法測序（一代測序）？Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上

2、的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進行檢測。3. 什么是SNP、SNV（單核苷酸位點變異）

3、？單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP） 和單核苷酸位點變異（single nucleotide variants, SNV）。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態(tài)性。不同物種、個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標(biāo)志。人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現(xiàn)1個單核苷酸多態(tài)性的變化，其中有些單核苷酸多態(tài)性可能與疾病有關(guān)，但可能大多數(shù)與疾病無關(guān)。單核苷酸多態(tài)性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據(jù)。在研究癌癥基因組變異時，相對

4、于正常組織，癌癥中特異的單核苷酸變異是一種體細胞突變（somatic mutation），稱做SNV。4. 什么是INDEL (基因組小片段插入）？基因組上小片段（50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。5. 什么是copy number variation （CNV）：基因組拷貝數(shù)變異？基因組拷貝數(shù)變異是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量。例如人類正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3，這樣，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區(qū)域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-

5、D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發(fā)生了C區(qū)域的擴增及缺失，擴增的位置可以是連續(xù)擴增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴增，如A-C-B-C-D。6. 什么是structure variation （SV）：基因組結(jié)構(gòu)變異？染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的變異。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起CNV的變化），染色體內(nèi)部的某塊區(qū)域發(fā)生翻轉(zhuǎn)顛換，兩條染色體之間發(fā)生重組（inter-chromosome trans-location）等。一般SV的展示利用Circos 軟件。7. 什么是Segment duplication？一般稱為SD區(qū)域，串聯(lián)重復(fù)是由序列相近的一些

6、DNA片段串聯(lián)組成。串聯(lián)重復(fù)在人類基因多樣性的靈長類基因中發(fā)揮重要作用。在人類染色體Y和22號染色體上，有很大的SD序列。8. 什么是genotype and phenotype？既基因型與表型；一般指某些單核苷酸位點變異與表現(xiàn)形式間的關(guān)系。9. 什么是Read？高通量測序平臺產(chǎn)生的序列標(biāo)簽就稱為reads。10. 什么是soft-clipped reads？當(dāng)基因組發(fā)生某一段的缺失，或轉(zhuǎn)錄組的剪接，在測序過程中，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區(qū)域，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對于鑒定染色體結(jié)

7、構(gòu)變異及外源序列整合具有重要作用。11. 什么是multi-hits reads？由于大部分測序得到的reads較短，一個reads能夠匹配到基因組多個位置，因而無法區(qū)分其真實來源的位置。一些工具根據(jù)統(tǒng)計模型，如將這類reads分配給reads較多的區(qū)域。12. 什么是功能基因組學(xué)？功能基因組學(xué)（Functuionalgenomics）又往往被稱為后基因組學(xué)（Postgenomics），它利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實驗手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學(xué)研究從對單一基因或蛋白質(zhì)得研究轉(zhuǎn)向多個基因或蛋白質(zhì)同時進行系統(tǒng)的研究。這是在基因組靜態(tài)的堿基序列

8、弄清楚之后轉(zhuǎn)入對基因組動態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究。研究內(nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達分析及突變檢測?；虻墓δ馨ǎ荷飳W(xué)功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對特異蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾；細胞學(xué)功能，如參與細胞間和細胞內(nèi)信號傳遞途徑；發(fā)育上功能，如參與形態(tài)建成等。采用的手段包括經(jīng)典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術(shù)不能對基因進行全面系統(tǒng)的分析，新的技術(shù)應(yīng)運而生，包括基因表達的系統(tǒng)分析（serial analysis of gene expression,SAGE），cDNA微陣列（cDNA microarray），DNA 芯片（DNA chip）和序列標(biāo)志片段顯示（seq

9、uence tagged fragmentsdisplay）。 13. 什么是比較基因組學(xué)？比較基因組學(xué)(ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。 14. 什么是表觀遺傳學(xué)？表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達了可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基

10、因組印記（genomicimpriting），母體效應(yīng)（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯（RNA editing）等。 15. 什么是計算生物學(xué)？計算生物學(xué)是指開發(fā)和應(yīng)用數(shù)據(jù)分析及理論的方法、數(shù)學(xué)建模、計算機仿真技術(shù)等。當(dāng)前，生物學(xué)數(shù)據(jù)量和復(fù)雜性不斷增長，每14個月基因研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)就會翻一番，單單依靠觀察和實驗已難以應(yīng)付。因此，必須依靠大規(guī)模計算模擬技術(shù)，從海量信息中提取最有用的數(shù)據(jù)。 16. 什么是基因組印記？基因組印記(又稱遺傳印記)是指基因根據(jù)親代的不同而有不同的表達。印記基因的存在能導(dǎo)致細胞中兩個等位基因的

11、一個表達而另一個不表達?；蚪M印記是一正常過程，此現(xiàn)象在一些低等動物和植物中已發(fā)現(xiàn)多年。印記的基因只占人類基因組中的少數(shù)，可能不超過5%，但在胎兒的生長和行為發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用?；蚪M印記病主要表現(xiàn)為過度生長、生長遲緩、智力障礙、行為異常。目前在腫瘤的研究中認為印記缺失是引起腫瘤最常見的遺傳學(xué)因素之一。 17. 什么是基因組學(xué)？基因組學(xué)（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。18. 什么是基因組注釋？基因組注釋(Geno

12、meannotation) 是利用生物信息學(xué)方法和工具,對基因組所有基因的生物學(xué)功能進行高通量注釋,是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的一個熱點?；蚪M注釋的研究內(nèi)容包括基因識別和基因功能注釋兩個方面。基因識別的核心是確定全基因組序列中所有基因的確切位置。二、DNA測序1. 什么是基因組重測序（Genome Re-sequencing）？全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，并在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴大到全基因組范圍。通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略進行高通量測序，實現(xiàn)在全基因組

13、水平上檢測疾病關(guān)聯(lián)的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價值。2. 什么是基因組de novo測序？de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測序所需的成本和時間較傳統(tǒng)技術(shù)都大大降低，大規(guī)?；蚪M測序漸入佳境，基因組學(xué)研究也迎來新的發(fā)展契機和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術(shù)以及強大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測定并分析所有生物的基因組

14、序列。3. 什么是外顯子測序（whole exon sequencing）？外顯子組測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢，但無法研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等。4. 什么是Chip？什么是Chip-seq？染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的

15、ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。5. 什么是DNA甲基化？DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。正常情況下，人類基因組“垃圾”序列的CpG二核苷酸相對稀少，并且總是處于甲基化狀態(tài)，與

16、之相反，人類基因組中大小為1001000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài)，并且與56的人類基因組編碼基因相關(guān)。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類基因組CpG島約為28890個，大部分染色體每1 Mb就有515個CpG島，平均值為每Mb含105個CpG島，CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對應(yīng)關(guān)系。由于DNA甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是 學(xué)的重要研究內(nèi)容。6. 什么是Scaffold？基因組de novo測序，通過reads拼接獲得Contigs后，往往還需要構(gòu)建454 Paired-end庫或Illumina Mate-pair庫，以獲得一定大小片

17、段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列。基于這些序列，可以確定一些Contig之間的順序關(guān)系，這些先后順序已知的Contigs組成Scaffold。7. 什么是Scaffold N50？Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然后將所有的Scaffolds按照從長到短進行排序，如獲得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3.Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Scaff

18、old總長度的一半時，最后一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度*1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標(biāo)準(zhǔn)。8. 什么是測序深度和覆蓋度？測序深度是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜

19、結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。 9. 什么是metagenomic（宏基因組）？Magenomics研究的對象是整個微生物群落。相對于傳統(tǒng)單個細菌研究來說，它具有眾多優(yōu)勢，其中很重要的兩點：1. (1) 微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個群落環(huán)境及個體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個個體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性； 2. (2) Metagenomics研究無需分離單個細菌，可以研究那些不能被實

20、驗室分離培養(yǎng)的微生物。 宏基因組是基因組學(xué)一個新興的科學(xué)研究方向。宏基因組學(xué)（又稱元基因組學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，生態(tài)基因組學(xué)等），是研究直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)的學(xué)科。傳統(tǒng)的微生物研究依賴于實驗室培養(yǎng)，元基因組的興起填補了無法在傳統(tǒng)實驗室中培養(yǎng)的微生物研究的空白。過去幾年中，DNA測序技術(shù)的進步以及測序通量和分析方法的改進使得人們得以一窺這一未知的基因組科學(xué)領(lǐng)域。三、RNA測序1. 什么是mRNA測序 （RNA-seq）？轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，即研究特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型與拷

21、貝數(shù)。Illumina提供的mRNA測序技術(shù)可在整個mRNA領(lǐng)域進行各種相關(guān)研究和新的發(fā)現(xiàn)。mRNA測序不對引物或探針進行設(shè)計，可自由提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄的客觀和權(quán)威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄、全新異構(gòu)體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。簡單的樣品制備和數(shù)據(jù)分析軟件支持在所有物種中的mRNA測序研究。 2. 什么是small RNA測序？Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動重要的調(diào)控因子，在基因表達調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等

22、生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠?qū)毎蛘呓M織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做進一步處理后，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規(guī)模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現(xiàn)包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預(yù)測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學(xué)應(yīng)用。 3. 什么是miRNA測序？成熟的microRNA（miRNA）是1724nt的單

23、鏈非編碼RNA分子，通過與mRNA相互作用影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，最終誘導(dǎo)基因沉默，調(diào)控著基因表達、細胞生長、發(fā)育等生物學(xué)過程?；诘诙鷾y序技術(shù)的microRNA測序，可以一次性獲得數(shù)百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達差異，為研究microRNA對細胞進程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。4. 什么是RIP-seq？RNA Immunoprecipitation是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。這種技術(shù)運用針對目標(biāo)蛋白的

24、抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進行測序分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。5. 什么是CLIP-seq？CLIP-seq,又稱為HITS-CLIP，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序

25、(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一項在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。其主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進行高通量測序，再經(jīng)生物信息學(xué)的分析和處理、總結(jié)，挖掘出其特定規(guī)律，從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對生命的意義。 6. 什么是表達譜？基因表達譜(geneexpression profi

26、le)：指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細胞或組織的非偏性cDNA文庫,大規(guī)模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達種類和豐度信息,這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達譜。7. 什么是Contig？拼接軟件基于reads之間的overlap區(qū)，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。8. 什么是Contig N50？Reads拼接后會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然后將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Con

27、tig 3.Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達到Contig總長度的一半時，最后一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度*1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標(biāo)準(zhǔn)。9. 什么是RPKM、FPKM？RPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway Mor

28、tazavi etal., 2008:每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1K個堿基上的reads個數(shù)。假如有1百萬個reads映射到了人的基因組上，那么具體到每個外顯子呢，有多少映射上了呢，而外顯子的長度不一，那么每1K個堿基上又有多少reads映射上了呢，這大概就是這個RPKM的直觀解釋。RKPM(exon)=109 *exon_tag_count/(total_tag_count*exon_size)RPKM(gene)=109 *gene_tag_count/(total_tag_count*canonical_transcript_size)如果對應(yīng)特定基因的話，那么就

29、是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的read。映射到外顯子上 總的reads個數(shù)。這個是映射到某個區(qū)域上的reads個數(shù)，這個區(qū)域或者是已知注釋的基因或者跨兩個外顯子的邊界或者是某個基因已經(jīng)注釋的轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子、外顯子。對于真核生物來說，外顯子和它們自己內(nèi)部的關(guān)系由某類型的mRNA來注釋。 外顯子的長度:計算時，計算所有某個基因已注釋的所有外顯子長度的總和。即使某個基因以多種注釋的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)，這個外顯子在求和時只被包含一次。即使部分重疊的外顯子共享相同的區(qū)域，重疊的外顯子以其總長來計算。 舉例：比如對應(yīng)到該基因的read有10

30、00個，總reads個數(shù)有100萬，而該基因的外顯子總長為5kb，那么它的RPKM為：109*1000(reads個數(shù))/106(總reads個數(shù))*5000(外顯子長度)=200或者：1000(reads個數(shù))/1(百萬)*5(K)=200這個值反映基因的表達水平。 FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM與RPKM計算方法基本一致。不同點就是FPKM計算的是fragments，而RPKM計算的是reads。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-

31、end的一個fragment，也可以是一個read。10. 什么是轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)？用測序的數(shù)據(jù)組裝成轉(zhuǎn)錄本。有兩種組裝方式：1，de-novo構(gòu)建； 2，有參考基因組重構(gòu)。其中de-novo組裝是指在不依賴參考基因組的情況下，將有overlap的reads連接成一個更長的序列，經(jīng)過不斷的延伸，拼成一個個的contig及scaffold。常用工具包括velvet，trans-ABYSS，Trinity等。有參考基因組重構(gòu)，是指先將read貼回到基因組上，然后在基因組通過reads覆蓋度，junction位點的信息等得到轉(zhuǎn)錄本，常用工具包括scripture、cufflinks。11. 什么是gene

32、fusion？將基因組位置不同的兩個基因中的一部分或全部整合到一起，形成新的基因，稱作融合基因，或嵌合體基因。該基因有可能翻譯出融合或嵌合體蛋白。四、RSNP分析1. 等位基因特異PCR等位基因特異PCR(Allele-specific PCR，AS-PCR)其基本原理是：根據(jù)SNP位點設(shè)計特異引物，其中一條鏈(特異鏈)的3末端與SNP位點的堿基互補(或相同)，另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進行設(shè)計，因此，AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因為特異引物在一種基因型中有擴增產(chǎn)物，在另一種基因型中沒有擴增產(chǎn)物，用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產(chǎn)物的有無，從而確定基因型的SNP。AS-P

33、CR技術(shù)的基本原理如圖1：等位基因1(Allele1)和等位基因2(Allele2)除SNP(T-C)位點外其他序列完全相同，引物P1、P2分別為根據(jù)等位基因1的SNP位點(T)和等位基因2的SNP位點(C)設(shè)計的特異引物(圖1A)。以基因型1(Genotype1)為模板，分別用引物P1和P2進行擴增，因為P1特異鏈的3末端剛好與基因型1的SNP位點T互補，所以能夠產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，P2特異鏈的3末端與基因型1的SNP位點T不互補，所以沒有擴增產(chǎn)物，因此基因型1是純合型TT；同樣基因型2(Genotype2)是純合型CC；以基因型3(Genotype3)是雜合型TC(圖1B)。根據(jù)凝膠電泳中有無帶

34、型就可以確定基因型的SNP(圖1C)。圖1.AS-PCR技術(shù)的原理2. 變性的高效液相色譜（DHPLC）變性的高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC),是一項在SSCP和DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的檢測SNP的突變技術(shù)。DHPLC亦稱為溫度調(diào)節(jié)的雜合雙鏈分析(TMHA)，具有半自動化、快速、檢出率高等特點，是一種新的高通量、自動化篩查SNPs的有效方法。通過PCR擴增出包含多態(tài)性位點的片段，由帶正電荷的流動相將帶負電荷的DNA分子吸附到固定相上。在加熱部分變性的條件下，若原先只有一種DNA，則只形成同源雙鏈分子

35、；若是2種DNA，哪怕只是1個堿基的錯配，也會形成2種同源雙鏈分子和2種異源雜合雙鏈分子。而存在同源和異源雙鏈?zhǔn)荄HPLC進行色譜分離的重要前提，利用發(fā)生錯配的異源雜合雙鏈DNA與完全匹配的同源雙鏈DNA解鏈特征(melting pelting)的差異，用離子對反向高效液相色譜法將它們分離開來并檢測異源雙鏈。在相同的部分變性條件下，錯配的異源雙鏈DNA因有錯配區(qū)的存在而更易變性，被色譜柱保留時伺(retention time)短于同源雙鏈DNA。在乙腈(acetonitrile)濃度梯度增加時，與固定相親和力較弱的異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫出來，從而發(fā)現(xiàn)DNA的突變，據(jù)此可用于檢測反相柱(r

36、everse-phasecolumns)中單個堿基置換、插入或缺失雜合二倍體的片段。這一技術(shù)1995年由0efner建立，現(xiàn)已有商業(yè)化的檢測儀器，稱為WAVE DNA片段分析系統(tǒng)，將其用于基因序列的比較、人類基因多態(tài)性的系統(tǒng)研究。實驗步驟:1. 1.PCR反應(yīng)（同前） 2. 2.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認。 3. 3.緩慢變性：95變性5分鐘，然后以0.03/S速率緩慢復(fù)性至25，使雜合子形成異源雙鏈。 4. 4.確定熔解溫度：根據(jù)溫度預(yù)測軟件對DNA片段進行序列分析，確定熔解溫度。 5. 5.取10l緩慢變性PCR產(chǎn)物上樣，分析流出峰峰形。 3. DGGE& TGGEDGGE(denat

37、uring gradient gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳，是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。溫度梯度凝膠電泳( temperature gradient gel electrophoresis ,TGGE)與DGGE非常類似，是通過溫度梯度使DNA解鏈從而區(qū)分不同堿基組成的DNA片段。TGGE/DGGE具體原理是：如果 DNA 雙鏈分子全長不斷增加溫度或用化學(xué)變性劑處理，兩條鏈就會開始分開（解鏈）。首先解鏈的區(qū)域由解鏈溫度較低的堿基組成。 G.C 堿基對比 A.T 堿基對結(jié)

38、合得要牢固，因此 G. C 含量高的區(qū)域具有較高的解鏈溫度。同時影響解鏈溫度的因素還有相鄰堿基間的吸引力（稱作“堆積”）。解鏈溫度低的區(qū)域，通常位于端部稱作低溫解鏈區(qū)（ lower melting domain ）。如果端部分開，那么雙螺旋就由未解鏈部分束在一起，這一區(qū)域便稱作高溫解鏈區(qū)（ high melting domain ( 圖 2) 。如果溫度或變性劑濃度繼續(xù)升高，兩條鏈就會完全分開。變性梯度凝膠電泳法依據(jù)首要的一點是： DNA 雙鏈末端一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會極劇下降（圖3 ）。第二個根據(jù)是，如果某一區(qū)域首先解鏈，而與其僅有一個堿基之差的另一條鏈就會有不同的解鏈溫度，因此

39、，將樣品加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳就可將二者分開。最終，如果一雙鏈在其低溫解鏈區(qū)堿基錯配（異源雙鏈），而與另一等同的雙鏈相比差別僅在于此，那么，含有錯配堿基的雙鏈將在低得多的變性劑濃度下解鏈。事實上，樣品通常含有突變、正常的同源雙鏈以及配對的異源雙鏈，后者是在 PCR 擴增加時產(chǎn)行的。而含有錯配的雙鏈通常可以遠遠地與兩個同源雙鏈分開，這種分離效果使該方法靈敏度很高。圖2.高溫解鏈區(qū)和低溫解鏈區(qū)圖3.不同構(gòu)象DNA片段的電泳遷移速度4. CRS-PCR-RLFP法DNA序列是由ATCG四種堿基按一定順序組成的核苷酸序列，特定的核苷酸序列構(gòu)成了限制性酶切位點。當(dāng)單個堿基發(fā)生突變時，可能引起限

40、制性內(nèi)切酶酶切位點的改變，經(jīng)過酶切反應(yīng)、電泳，可以很直觀的進行基因分型。獲得目的基因或序列后，對其進行序列分析，看其是否含有限制性內(nèi)切酶酶切位點。如果有我們感興趣的酶切位點，可以直接采用RFLP的方法，觀察基因分型。但并不是所有的目的序列都含有酶切位點，或原有的限制性內(nèi)切酶價格比較昂貴。隨著科研的需要，科研工作者發(fā)明了改進的RFLP方法CRS-PCR-RFLP。CRS-PCR-RFLP （created restriction site PCR）：是從PCR-RFLP衍生出來的目前較為廉價的檢測基因多態(tài)性的方法。它在靠近引物3末端引入錯配位點以和已知的SNP位點形成限制性內(nèi) 切酶酶切位點，從而

41、可以通過RFLP來檢測樣本基因型。注意事項:1. CRS-PCR產(chǎn)物酶切后，不同等位基因間片段的長度差異只有一個引物的長度（20-25bp），如果擴增的片段較大，將給基因型的判斷帶來很大不便，因此應(yīng)用CRS-PCR時，擴增的長度應(yīng)該在100bp以內(nèi)為好。 2. 2.CRS引物選擇的余地較小，只能利用多態(tài)性位點的近旁序列，當(dāng)臨近多態(tài)性位點的正向序列不適合作為引物序列時，可選擇其反向序列作為引物，反之亦然。 3. 3.當(dāng)引物3序列與模版出現(xiàn)G-A、G-G或C-C的堿基錯配時，PCR的擴增效率會受到顯著影響，有可能引起引物無法延伸。 4. 4.3末端錯配堿基較多（超過3個時），將嚴(yán)重影響PCR的擴增

42、效率。 5. 5.設(shè)計引物時，應(yīng)考慮限制性內(nèi)切酶的價格等。 6. 6.設(shè)計引物網(wǎng)址：/dcaps/dcaps.html 5. SSCP法DNA分子通常以雙鏈形式存在，在高溫變性的情況下，雙鏈分子解成單鏈。單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變。空間構(gòu)想有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開。這種方法被稱為單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single - strand conformational polymorphism，SSCP)。在隨后的研究中，SSCP又用于檢查PCR擴增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP技術(shù)，進一步提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性。其基本過程是:PCR擴增靶DNA；將特異的PCR擴增產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或