Rh血型系統(tǒng)研究進(jìn)展

1、程變化等方面,脂聯(lián)素測定也有一定意義。最近多項(xiàng)研究表明,脂聯(lián)素的高分子量異構(gòu)體(HMW與冠心病的相關(guān)性更強(qiáng)1-3。故今后通過大規(guī)模臨床試驗(yàn)闡明HMW 在冠心病發(fā)生、發(fā)展中的意義,將是研究的熱點(diǎn)。6.2 治療 高血漿脂聯(lián)素水平能在體內(nèi)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。將表達(dá)人脂聯(lián)素的腺病毒轉(zhuǎn)染載脂蛋白E 缺乏的小鼠,第14d 后動(dòng)脈竇處的動(dòng)脈粥樣斑塊形成被抑制了30%,免疫組化分析顯示腺病毒攜帶的脂聯(lián)素轉(zhuǎn)移入粥樣硬化動(dòng)脈處脂紋的泡沫細(xì)胞內(nèi)19。脂聯(lián)素具有抑制機(jī)械損傷后血管內(nèi)膜反應(yīng)性增生的作用。Matsuda 等發(fā)現(xiàn),機(jī)械性動(dòng)脈損傷可使脂聯(lián)素基因缺失的小鼠出現(xiàn)明顯的新生內(nèi)膜增厚和平滑肌細(xì)胞增殖。而外源性補(bǔ)充

2、脂聯(lián)素后,可減弱其新生內(nèi)膜的增殖。這為冠心病血管介入治療后,預(yù)防血管再狹窄提供了新的辦法20。參考文獻(xiàn):1 Pajvani UB,Du X,Combs TP,et al .Structure -func tion s tudies of theadipocyte -secreted hormone Acrp30P adiponecti n:i mplications for meta -bolic regulation and bi oactivityJ.J Bi ol Chem,2003,278(11:9073-9085.2 Pajvani UB,Hawki ns M ,Combs TP,e

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4、cular weight form of adi ponectinJ.Circ Res,2004,94(4:e27-31.4 Ohas hi K,O uchi N,Kihara S,et al .Adiponecti n I164T mutation i s as -s ociated with the metabolic s yndrome and coronary artery diseaseJ.JA m Coll Cardiol,2004,43(7:1195-1200.5 Stenvi nkel P,Marchlewska A,Pecoits -Fil ho R,et al .Adi p

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6、e and causes weight loss in miceJ.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(4:2005-2010.7 Lin LY,Lin CY,Su TC,e t al .Angiotensin II -induced apoptos is in hu -man endothelial cells is inhibi ted by adiponectin through restoration ofthe as soci ation bet ween endothelial ni tric oxide synthas e and heat shock

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8、suppresses li pid accumulati on and class A scavenger re -ceptor expression in human monocyte -deri ved macrophagesJ.Circula -ti on,2001,103(8:1057-1063.10 劉巖,鄒大進(jìn),李慧,等.低脂聯(lián)素血癥是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志J.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2005,21(1:5-8.11 Nakamura Y,Shi mada K,Fukuda D,et al .Implications of plasma con -centrations o

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10、nectin,metabolic risk factors ,and cardi ovascular events among patients with end -stage renal diseaseJ.J A m Soc Nephrol,2002,13(1:134-141.14 Schulze MB,Shai I,Ri mm EB,et al .Adi ponectin and future coronary heart disease events a mong men with type 2di abetes J .Diabetes,2005,54(2:534-539.15Kumad

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12、cyte deri ved protein,adiponecti n,in pa -ti ents w i th acute myocardial infarc tionJ.Heart (British Cardiac Soc-i ety,2003,89(6:667.17Is hika wa Y,Akasaka Y,Ishii T,et al .Changes in the di stribution pat -tern of gelatin -bindi ng protein of 28kDa (adiponectini n myocardial remodelli ng after isc

13、hae mic inj ury J .His topathology,2003,42(1:43-52.18 洪潔,顧衛(wèi)瓊,張翼飛,等.胰島素抵抗綜合征患者血清脂連素和胰島素敏感性的相關(guān)性研究J.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2003,19(3:173-176.19Yoshi hisa O,Shinji K,Noriyuki O,et al .Adiponecti n reduces athero -sclerosisi n apolipoprotein E -deficient miceJ.Circ ulati on,2002,106(22:2767-2770.20Matsuda M ,Shimomur

14、a I,Sata M.Role of adi ponectin in preventing vascular s tenosis.The mis sing link of adipo -vasc ular axis J.J Biol Che m,2002,277(40:37487-37491.收稿日期:2005-10-22 修回日期:2006-03-16Rh 血型系統(tǒng)研究進(jìn)展卓傳尚1(綜述,卓孝福2,郭永建2(審校(1.福建醫(yī)科大學(xué),福州350004;2.福建省血液中心,福州350004中圖分類號(hào):R457.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-2084(200611-0684-03摘要:

15、Rh 血型系統(tǒng)是最具多態(tài)性的紅細(xì)胞血型系統(tǒng),在臨床輸血、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血中具有重要意義。本文就R H 基因結(jié)構(gòu)、R H 等位基因、Rh 蛋白功能及Rh 血型基因分型等近年來的研究進(jìn)展簡要綜述。關(guān)鍵詞:R h 血型;R H 基因;等位基因;基因分型 The Research Progress of Rh B lood G roup System Z HUO Chuan -shang 1,ZHUO Xiao -fu 2,GUO Yong -j ian 2.(1.Fuj ian Medic al Unive rsit y ,Fuzhou 350004,China ; 2.Blood

16、 Ce nter o f Fujian ,Fuzhou 350004Abstract :Rh blood group s ys tem is the mos t polymorphic s ys te m of the human red cell blood groups havi ng great si gni ficance in clinical trans fusion,he molytic di seas e of the ne wborn (HDNand autoi mmune hemol ytic anemia (AIHA.This review summariz es the

17、 developing kno wledge of Rh blood group i n recent years,including Rh gene s tructure,and i ts allele,the function of Rh protei n and genotyping in Rh blood group.Key words :Rh blood group;RH gene;Allele;Geotypi ngRh 血型系統(tǒng)是最具多態(tài)性的紅細(xì)胞血型系統(tǒng),至少由46種不同抗原組成,其中與臨床相關(guān)的主要為D 、C 、c 、E 和e 等5種抗原。Rh 血型不符可引起新生兒溶血病(HD

18、N、溶血性輸血反應(yīng)和自身免疫性溶血性貧血(AIHA。20世紀(jì)90年代初,Rh 血型系統(tǒng)cDNA 被克隆出來。此后,Rh 血型系統(tǒng)的研究取得了巨大進(jìn)展,Rh 血型基因結(jié)構(gòu)和多數(shù)變異體的分子基礎(chǔ)已經(jīng)闡明,Rh 血型基因分型的研究方興未艾,Rh 血型蛋白功能研究也初現(xiàn)端倪。1 Rh 血型基因結(jié)構(gòu)Rh血型基因(RH位于人類染色體1p34.336.1,由緊密連鎖的RhD蛋白基因(RHD基因和RhCE蛋白基因(RHCE 基因串聯(lián)排列組成。RHD基因和RHCE基因高度同源(93.8%,都有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子,長分別為57932bp 和58575bp,都編碼417個(gè)氨基酸1。二者的第8個(gè)外顯子完全相同,

19、差異較大是外顯子3、4、5、7、9和內(nèi)含子4;與RHCE 基因相比,RHD基因的內(nèi)含子4缺失651bp。R HD基因和RHCE基因的開放閱讀框架(ORF在RH基因座位上方向相反,3c末端相對(duì),相距約30000bp,包括下游Rh盒(Rhesus box和約20000bp的小膜蛋白1(SMP1基因。下游Rh盒起于RHD基因終止密碼子3c端104bp處,長9145bp;此外,在距RHD基因起始密碼子5c端約4900bp處還存在1個(gè)9142bp的上游Rh盒。上、下游Rh盒的方向與RHD基因相同,前二者同源性高達(dá)98.6%。在上、下游Rh盒的57017163之間有一段1463bp的相同區(qū)域,在該區(qū)域除下

20、游Rh盒有1個(gè)4bp的多聚體插入外,其他序列完全相同。Wagner等2認(rèn)為R HD陰性單倍體是由上下游Rh盒觸發(fā)的不等交換引起,并且確定RHD基因缺失的903bp斷裂點(diǎn)區(qū)就位于該區(qū)域。2Rh蛋白及其功能RhD蛋白由RHD基因編碼,攜帶D抗原,RhCE蛋白由RHCE基因編碼,攜帶C P c和E P e抗原。RhD和RhCE蛋白結(jié)構(gòu)相似,都是由416個(gè)氨基酸殘基組成的疏水性非糖基化蛋白,分子質(zhì)量分別為30103和32103;二者都有12個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和6個(gè)細(xì)胞外環(huán),其C端和N端都位于胞漿內(nèi)。通常,2條RhD蛋白或2條RhCE蛋白與2條RhAG形成四聚體,再與CD47、Landsteiner-Wi

21、ener糖蛋白(簡稱LW糖蛋白和血型糖蛋白B(GPB等附屬蛋白組成蛋白復(fù)合體插入紅細(xì)胞膜,參與構(gòu)成紅細(xì)胞膜骨架,維持紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性3。Rh 蛋白還可影響紅細(xì)胞膜上的其他骨架蛋白的表達(dá),例如RhCE 蛋白表達(dá)明顯減少或缺失(如D-表型都將使CD47表達(dá)下降3。此外,Rh蛋白可能還參與氨(NH3或銨離子(NH+4跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持紅細(xì)胞內(nèi)外電荷平衡。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Rh 蛋白家族(RhD、RhCE、Rh AG、RhBG和RhCG與原核生物銨轉(zhuǎn)運(yùn)體(Amt P MEP有共同的保守性區(qū)域。深入研究顯示,表達(dá)RhAG的釀酒酵母氨轉(zhuǎn)運(yùn)體缺陷突變株能夠利用氨為惟一氮源4,表達(dá)RhAG的非洲蟾卵對(duì)14C-甲

22、基-NH3Cl的攝取率比對(duì)照組高810倍5。此外,研究表明非紅系Rh蛋白同源物RhBG和RhCG也能促進(jìn)銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)6。最近,Hemker等7研究顯示,在NH4Cl類似物14C-甲基-NH3Cl溶液孵育后,調(diào)節(jié)型RHnull 紅細(xì)胞(不表達(dá)Rh蛋白內(nèi)積聚的14C-甲基-NH3Cl明顯高于正常紅細(xì)胞,而無效基因型RH null紅細(xì)胞(表達(dá)少量Rh蛋白內(nèi)積聚中等量的14C-甲基-NH3Cl。雖然上述研究表明,Rh 蛋白家族成員RhCE P RhD蛋白、RhAG、RhB G和RhCG以及Rh復(fù)合體具有參與NH3跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。3RH等位基因人類正常RH基因編碼區(qū)序列一致,但在漫長的

23、進(jìn)化途中,不同人種間發(fā)生各種不同的分子事件,包括基因缺失、基因重組和堿基變異等,形成了眾多的RH等位基因。3.1R HD等位基因目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的RHD等位基因有80多種,其中單核苷酸多態(tài)性(SNPs引起的RHD等位基因達(dá)40多種,RHCE和RHD基因交換引起的RHD等位基因也有30多種。這些RHD等位基因可分為以下四大類:¹RhD陰性等位基因:大部分D陰性的高加索人和中國人完全缺失RHD基因,約有15.8%真實(shí)D陰性中國人攜帶RhD陰性等位基因8,而D陰性非洲黑人則普遍攜帶RhD陰性等位基因(82%,其中66%為RHD偽基因(RHD W9。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)22種不同的RhD陰性等位基因,其

24、分子基礎(chǔ)包括基因重組(如各種RHD-CE-D雜交基因、堿基突變(如RHD48A、RHD 121T和RHD270A等、堿基缺失(如RHD488del4和RHD 710delC或插入(如RHD IVS8+1G>A和RHD IVS6+1-4de-l GTAA,904-905insGGC TT。堿基突變?yōu)殄e(cuò)義突變或無義突變,堿基插入和缺失引起框移突變,導(dǎo)致終止密碼子提前產(chǎn)生,最終的結(jié)果是紅細(xì)胞表面Rh蛋白表達(dá)缺失;º部分D等位基因:該型的分子基礎(chǔ)是堿基突變和基因交換,但是RHD基因的ORF未發(fā)生改變,導(dǎo)致RhD蛋白缺失一個(gè)或多個(gè)D抗原表位;例如,DÖ是高加索人最常見的部分D,

25、就是由于RHD基因的2、3或4個(gè)外顯子被相應(yīng)的RHCE基因的外顯子所置換,分別為DÖa、DÖb和DÖc;»弱D等位基因:目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近30種弱D等位基因,其分子基礎(chǔ)都是點(diǎn)突變,這些突變位點(diǎn)編碼的氨基酸殘基通常集中在RhD蛋白的213、149、179225和269397位氨基酸殘基等4個(gè)區(qū)域,都位于RhD蛋白的胞質(zhì)區(qū)或跨膜區(qū),因此可影響該蛋白有效插入紅細(xì)胞膜,導(dǎo)致紅細(xì)胞膜上RhD蛋白表達(dá)量的下降10;¼D el等位基因:主要存在亞洲人群中,大約25.5%相對(duì)RhD陰性中國人實(shí)際為D el 表型8。目前已經(jīng)報(bào)道的D el等位基因有6種11-14:

26、RHD1227A、RHD885T、RHDIVS3+1G>A、RHDdel1013bp、RHD (X418L和RHDIVS5-38del4,其中RHD1227A引起錯(cuò)義突變, RHDIVS3+1G>A和RHD885T引起mRNA剪接點(diǎn)改變,RHD (X418L則是由于RHD基因外顯子10的1252和1253位核苷酸插入1個(gè)T核苷酸,引起框移突變,造成原先RHD基因翻譯終止密碼子TAA(X變成TTA(L,導(dǎo)致編碼的RhD蛋白從417個(gè)氨基酸變?yōu)?88個(gè)氨基酸。但是仍不清楚這些突變是如何造成RhD蛋白表達(dá)異常減少。3.2RHCE等位基因人類最為古老的RHCE等位基因?yàn)镽Hce等位基因,R

27、Hce等位基因經(jīng)過突變或與RHD基因交換形成RHcE、RHCe和RHCE等位基因15。RHce、RHcE、RHCe 和RHCE等位基因進(jìn)一步發(fā)生基因缺失(如D-、堿基變異(如ceMO、cE MI、ceEK、ceBI和ceAR等、或與RHD基因發(fā)生基因交換(如E變異體Ò和Ó型、ceNR和RHEKK等,產(chǎn)生眾多的RHCE等位基因。目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)22種RHCE等位基因1,而且隨著研究的不斷深入,還將不斷發(fā)現(xiàn)新的R HCE等位基因。多數(shù)RHCE等位基因引起e抗原表達(dá)改變,少數(shù)引起E抗原表達(dá)異常,而影響c抗原表達(dá)改變的則較為少見。4Rh血型基因分型目前臨床Rh血型鑒定仍采用傳統(tǒng)的血

28、清學(xué)方法,該方法檢測的結(jié)果較為準(zhǔn)確,而且與臨床輸血和疾病相關(guān)性密切。但該方法的結(jié)果判定具有主觀性,在弱的或混合視野型凝集反應(yīng)時(shí)尤其突出,從而影響結(jié)果的可靠性;對(duì)于存在同種抗體或自身抗體的個(gè)體,其Rh血型的鑒定常需用酶或其他技術(shù)處理紅細(xì)胞,這些處理往往會(huì)破壞紅細(xì)胞表面抗原,從而可能影響鑒定結(jié)果,而且實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣;對(duì)多次輸血或大量輸血的患者,由于這些個(gè)體的外周血中存在大量的供者紅細(xì)胞,因此用該方法通常難以準(zhǔn)確定型;此外,Rh血型變異體眾多,尤其是某些罕見變異體,不僅制備這些變異體的抗體的費(fèi)用昂貴,也難以獲得滿意的譜細(xì)胞。隨著Rh血型基因結(jié)構(gòu)和多數(shù)變異體的分子基礎(chǔ)的闡明,許多學(xué)者開始致力于Rh血

29、型基因分型的研究。第一個(gè)Rh血型基因分型方法建立于1991年,該方法應(yīng)用Southern Blotting檢測RhD基因型,但是該方法繁瑣且需要特殊儀器,不適用于臨床實(shí)驗(yàn)室。1993年,Bennett等16首次建立RHD 基因的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR分型方法,該方法通過檢測RHD 基因3c端非編碼區(qū)來預(yù)測RhD表型,但隨后的研究發(fā)現(xiàn)該方法存在較大的假陽性和假陰性問題。近年來,出現(xiàn)了多種以PCR為基礎(chǔ)的Rh血型基因分型方法,而以下列4種方法運(yùn)用較多:¹PCR-序列特異性引物(PCR-SSP:根據(jù)RH基因特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)序列特異性引物,特異性擴(kuò)增RH基因某個(gè)外顯子或內(nèi)含子,是最常用的Rh血型

30、基因分型技術(shù)之一。目前傾向于應(yīng)用多重PCR-SSPs進(jìn)行Rh血型基因分型,同時(shí)分析多個(gè)RH基因特異性位點(diǎn),該策略因簡便和準(zhǔn)確而備受關(guān)注;ºPCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP:限制性酶切PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行長度多態(tài)性分析,可以檢測限制性位點(diǎn)的單核苷酸替換,但是與PCR-SSP相比,PCR-RFLP比較繁瑣費(fèi)時(shí),且不適用于多重PCR。PCR-RFLP在Rh血型基因分型上的兩個(gè)重要應(yīng)用是RHD合子型鑒定和D P c P C分型;»實(shí)時(shí)定量PCR:常用于檢測孕婦外周血中微量的胎兒DNA,是胎兒Rh血型鑒定的首選方法,也適用于直接檢測RHD合子型。最近研究顯示,由于Rh盒

31、的DNA序列(尤其是非高加索人群存在較多變異,該技術(shù)在鑒定非高加索人個(gè)體的RHD合子型時(shí)優(yōu)于PCR-RFLP和PC R-SSP法17,18。實(shí)時(shí)定量PCR的不足之處在于需要特殊的儀器,且費(fèi)用昂貴;¼DNA測序:對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序可以檢測RH基因多態(tài)性,確定各種堿基變異位點(diǎn),但費(fèi)用較高,難以廣泛用于臨床。雖然Rh血型基因的分型技術(shù)有多種,但是單獨(dú)運(yùn)用這些技術(shù)檢測RH基因的某個(gè)外顯子或內(nèi)含子,可能產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。假陽性通常由無效等位基因引起,假陰性則由其他R H等位基因引起。目前,Rh血型基因分型策略通常是,根據(jù)不同民族或人群中RHD和RHCE等位基因分布頻率和特點(diǎn),設(shè)計(jì)特

32、異性引物,擴(kuò)增RH基因的多個(gè)特異性位點(diǎn)及多種等位基因,從而即簡化操作又準(zhǔn)確分型,將假陽性率和假陰性率降到較低水平。目前Rh血型基因分型已逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用,在2004年的國際輸血聯(lián)合會(huì)第28屆年會(huì)上Danials等19提出以下5種情況可以應(yīng)用血型基因分型:¹產(chǎn)前胎兒血型鑒定,預(yù)測胎兒和新生兒溶血病(HDFN的危險(xiǎn)性;º多次輸血患者或大量輸血患者的Rh血型鑒定;»當(dāng)血清學(xué)試劑質(zhì)量較差或試劑短缺時(shí),亦可用血型基因分型篩選供者;¼血型基因分型還適用于直接抗球蛋白試驗(yàn)(DAT陽性,但間接抗球蛋白試驗(yàn)(IAT又無法分型血液標(biāo)本的鑒定;½作為血清學(xué)參比實(shí)驗(yàn)室

33、的輔助技術(shù),用于試劑紅細(xì)胞的篩選和質(zhì)量控制20,也可以用于檢測Rh血型變異體。5結(jié)束語Rh血型系統(tǒng)是最具多態(tài)性的紅細(xì)胞血型系統(tǒng),不同種族間的RH基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能存在較大差異。目前,多數(shù)Rh血型的PCR分型方法是根據(jù)歐美人的RH基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)建立的,不完全適用于中國人。要想建立針對(duì)中國人的Rh血型基因分型方法,首先必需深入研究各民族、各地區(qū)中國人R H基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn),充分了解中國人各等位基因的分子基礎(chǔ)與基因頻率。值得注意的是,由于D el表型在相對(duì)D陰性中國人群中比率較高13,而真實(shí)D陰性個(gè)體可產(chǎn)生針對(duì)D el表型的同種抗D抗體17,因此,深入研究中國人D el表型及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)具有重要意義。參

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