牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法

1、牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法 隨著奶牛飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展， 抗生素在預(yù)防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應(yīng)用。 生 鮮牛奶中抗生素的來源主要是： 第一，治療泌乳期病牛時使用的抗生素會從奶牛 體內(nèi)移行到乳腺殘留進(jìn)入牛奶中， 資料表明治療后的奶牛， 其擠出的牛奶 5 天內(nèi) 都有抗生素殘留； 其二，為了預(yù)防奶牛疾病并提高產(chǎn)量， 在奶牛飼料中添加抗生 素也會造成牛奶中抗生素的殘留；第三，由于牧場管理不善，擠奶、儲奶沒有嚴(yán) 格的衛(wèi)生制度和配套的設(shè)施，人為添加或造成牛奶抗生素的污染。 牛奶中含有抗生素， 不僅對人的健康造成很大的危害， 而且對乳品加工企業(yè)帶來 經(jīng)濟(jì)損失（因無法生成酸奶和奶酪）。因此必須嚴(yán)格控制

2、牛奶中抗生素殘留，除 了要做好科學(xué)飼養(yǎng)、 精心管理；正確擠奶和預(yù)防疾病外， 還要規(guī)范抗生素的使用， 按國標(biāo)中有關(guān)規(guī)定， 用藥后的奶牛 5 天后所產(chǎn)的牛奶才可作為原料乳， 并且要檢 測其殘留。世界糧農(nóng)組織（FAO、世界衛(wèi)生組織（WH）、歐盟（EC及美國的 食品和藥品管理局（FDA等對食品中抗生素最大殘留量都有明確的規(guī)定，我國 也有鮮奶中抗生素殘留量檢驗標(biāo)準(zhǔn)（ 94）。 目前，鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類： 生物測定法（微生物測定法、 放射受體測定法）、免疫法（放射免疫法、熒光免疫法、酶聯(lián)免疫法）、理化分 析法（波譜法、色譜及聯(lián)用技術(shù)）。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素殘留檢測 方法。TT

3、C法TTC法是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標(biāo)準(zhǔn)（一94）的檢測法，屬生物檢測法。 其測定原理基于抗生素對微生物的抑制作用。 如果牛奶中含有抗生素， 則加入菌 種（嗜熱鏈球菌）經(jīng)培育3小時后,加入TTC指示劑（三苯基四氮唑）不發(fā)生還原 反應(yīng), 所以樣品呈無色狀態(tài) ; 如果牛奶中不含抗生素 , 則樣品呈紅色 . 這樣實(shí)驗后 樣品顏色不變的為陽性 , 樣品染成紅色的為陰性。TTC法的具體操作步驟：1. 菌液制備：將單菌種（嗜熱鏈球菌）以脫脂乳為培養(yǎng)基，在36± 1 C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng) 15 小時后 , 再以脫脂乳以至于 1：1 稀釋待用 ;2. 取待檢樣液9mL,在80C水浴加熱5分鐘后冷卻到

4、37C以下,加活菌液1mL,在 36C± 1C水浴2小時，加入4%1 勺TTC指示劑,36 C± 1C水浴培養(yǎng)30分鐘；3. 若樣液顏色不變?yōu)殛栃?, 呈紅色為陰性 ; 若陽性的樣液 , 再置于水浴中培養(yǎng) 30 分鐘 , 不顯色的為陽性 , 呈紅色為陰性 .TTC法測定各種抗生素的靈敏度為：青霉素:4ppb,鏈霉素:500ppb,慶大霉 素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有費(fèi)用低,易開展的優(yōu)點(diǎn)；缺點(diǎn)是耗時長，要 求操作人員需有一定專業(yè)知識且實(shí)驗過程中菌液的制備、 水浴過程控制都要求嚴(yán) 格遵守操作規(guī)程，否則易出現(xiàn)假陽性，以致出現(xiàn)檢驗結(jié)果的不穩(wěn)定性。 Delvot

5、est sp 法（戴爾沃檢測法） 該法最早在香港傳到廣東的， 其使用是基于 20 世紀(jì) 80 年代初香港要求廣東出口 的生奶必須“無抗”且要求采用 Delvotest 法檢測。該方法也是生物測定法， 其 試劑是由荷蘭DSM公司生產(chǎn)并由AOA（認(rèn)證。原理是利用微生物一嗜熱芽胞菌在 64C條件下培養(yǎng)3小時后會產(chǎn)酸，酸引起指示劑BCP溴甲酚紫）變?yōu)辄S色;若牛 奶樣品中不含抗生素 , 培養(yǎng)后樣品呈黃色 , 如樣品中含有抗生素 , 嗜熱芽胞菌生 長受到抑制而無法產(chǎn)酸 , 指示劑將不變色 .Delvotest sp 法的操作步驟 :1. 以無菌操作將一片營養(yǎng)藥片夾放入小試管內(nèi) ;2. 用微量移液管將牛奶樣

6、品注入小試管內(nèi) ;3. 把小試管放入已預(yù)熱至64C的水浴箱或恒溫器中培養(yǎng)；4）. 定時 3 小時取出觀察顏色變化 . 如果底部 2/3 的固體介質(zhì)是黃色 , 則為陰性 , 如果底部 2/3 的固體介質(zhì)是紫色 ,則為陽性 .Delvotest sp 法具有廣譜性 ,可檢測到 -內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的更多抗生素 , 如 磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氯霉素等，其中對青霉素和磺胺 類抗生素特別靈敏 . 其靈敏度為：青霉素 :3ppb, 鏈霉素 :300ppb, 慶大霉 素 :400ppb, 卡那霉素 :2500ppb 。 Delvotest sp 法集操作方便，嚴(yán)格實(shí)用，容易 判斷，結(jié)果可

7、靠，費(fèi)用適中等優(yōu)點(diǎn)；但也易出現(xiàn)假陽性，實(shí)驗證明：當(dāng)牛奶樣品 中添加微生物防腐劑（如乳酸鏈球菌素 Nisn ）或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時， 便可影響嗜熱芽胞菌生長而使實(shí)驗為陽性。Snap 法該方法是酶聯(lián)免疫法，由美國IDEXX公司生產(chǎn)其檢測分析儀及其試劑盒，均獲得 AOA（認(rèn)證，它利用了竟?fàn)幟嘎?lián)免疫技術(shù)。其基本原理是用特異性抗體將固相載 體激活，加入含待測抗原的溶液和一定量的酶標(biāo)記抗原在45C± 5C共同保溫，使樣品內(nèi)的抗生素與內(nèi)置抗生素標(biāo)志物竟?fàn)幣c固定的抗體結(jié)合， 然后進(jìn)行洗滌和 顯色，內(nèi)置抗生素標(biāo)志物與固定的抗體結(jié)合形成的復(fù)合體， 通過酶的作用分解可 形成有色物質(zhì)，通過測定色度并

8、與參照物對照，就可以確定結(jié)果是陽性或陰性。Snap法操作步驟：1. 加入乳樣于樣品管中 ,搖勻,加熱樣品和檢測板 5分鐘；2. 加入乳樣于樣品孔中,當(dāng)激活圓環(huán)開始退卻時,按Snap鍵；3. 反應(yīng)4分鐘，由Snap讀數(shù)儀讀取并打印結(jié)果檢測讀數(shù)小于時判為陰性，大于時 判為陽性 .Snap法是一種將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方 法，其敏感性和特異性好，檢測的靈敏度以普遍使用的-內(nèi)酰胺類計：青霉素：5ppb, 阿莫西林 :10ppb, 氨芐西林 :10ppb, 頭孢西林 :8ppb. 其他抗生素如四環(huán)素等的檢 測,則需購買相應(yīng)的試劑來檢測 . Snap 法檢測結(jié)果快速準(zhǔn)確 ,

9、 9 分鐘內(nèi)即可檢測 出牛奶中 -內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，且有半定量的讀 數(shù)，可監(jiān)控牧場用藥的情況；檢測儀器穩(wěn)定性良好，結(jié)果重現(xiàn)性高，整個檢測過 程簡單方便；但需購置專用儀器和試劑，成本較高。高效液相色譜檢測法它是一種理化檢測方法 , 是利用抗生素分子中的基團(tuán)所具有的特殊反應(yīng)來測定其 含量. 檢測的過程采用了氣相色譜理論 , 通過高壓液相和高靈敏度的檢測器 , 分離 速度快、效率高和操作自動化。一般要經(jīng)過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱 凈化、衍生化等步驟， 能檢測抗生素的具體含量， 敏感性較高， 但檢測程序復(fù)雜， 費(fèi)用較高，需購買色譜儀等檢測設(shè)備，不適合小型檢驗室。 傳

10、統(tǒng)的抗生素檢測方法不少 , 有的操作煩瑣 , 有的實(shí)驗條件要求高 , 有的檢驗時間 太長； 這些不僅會給乳制品生產(chǎn)企業(yè)造成經(jīng)濟(jì)上和時間上的損失 , 而且檢測結(jié)果 常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響 . 鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類 健康的公共衛(wèi)生問題 , 乳品企業(yè)及牧場應(yīng)重視和加強(qiáng)檢測工作 , 應(yīng)用一些簡單、快 速和準(zhǔn)確性高的方法來監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量，保證消費(fèi)者的健康。foodonline/id=15933反應(yīng)原理 本產(chǎn)品主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學(xué)反應(yīng)的基本原理來進(jìn)行的。 在整 個反應(yīng)當(dāng)中 , 樣品中氯霉素含量越多，反應(yīng)呈色就越淡。反之，樣品中氯霉素含 量越少，則呈色越深。試劑盒組

11、成1、微量測試孔：每條 8 孔，每板 12條2、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：0ppb、 ppb 、 ppb ，瓶3、10 倍濃縮萃取稀釋液：一瓶， 30ml/ 瓶4、10倍濃縮洗滌液：一瓶， 30 ml / 瓶5、氯霉素酶標(biāo)記物： 一瓶，8 ml/ 瓶6、底物溶液：一瓶， 12 ml/ 瓶7、反應(yīng)終止液：一瓶， 13 ml/ 瓶 使用說明A、注意事項1、使用前先將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液 6 瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標(biāo)記物， 底物溶液及微量測試孔條置于室溫下，回溫 30 分鐘。2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配制用蒸餾水將 10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以 1： 9 的比例稀釋（即 1mL 濃縮液+9mL

12、蒸餾水），即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。3、回溫后， 取出所需微量測試孔條， 將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好， 置于 4oC 保存。B、樣品制備1. 待測物為生乳，則依以下方法進(jìn)行處理 （5 倍稀釋 ）取 100ul 待測生乳加入 400ul 萃取稀釋液，振蕩混合后備用。2. 待測物為蜂蜜，則依以下方法進(jìn)行處理a. 取2g蜂蜜、4ml蒸餾水與2ml乙酸乙酯置入離心管中，震蕩約 5分鐘，使其 充分混合均勻。b. 離心10分鐘（3000rpm），取上清液（乙酸乙酯）至玻璃管中，于50C下氮?dú)獯?干（溫度請勿超過 50oC）。c. 加入萃取稀釋液，震蕩約 10 秒鐘后備用。3. 待測物

13、為血清、則依以下方法進(jìn)行處理a. 抽取待檢動物血液， 離心或靜置取其較透明之上層液 （血清層）使用，注意不要 有溶血。b. 將3ml血清加入離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震蕩混合約30秒。c. 離心10分鐘（3000rpm），取2ml上層液（乙酸乙酯）至玻璃管中，于50oC下氮 氣吹干。d. 于此玻璃管中加入正己烷2ml，先將殘余物完全溶解后，再加入 1 ml萃取稀 釋液，震蕩約 30 秒鐘。e. 離心 1 0分鐘（3000 rpm） ，用吸管吸去上層液 （正己烷） 及中間乳化層部分， 棄掉。再吸取下層液 （ 水層） 備用。f. 若有乳化現(xiàn)象，請先將大部分上層液 （正己烷）取出后，再將玻璃管

14、置入 80oC 水中，隔水加熱約 5 1 0分鐘，可改善乳化情形。4. 待測物為雞肉或魚、蝦，則依以下方法進(jìn)行處理a. 將 3 克樣品剪碎后放入 50 ml 離心管中，再加入 6ml 乙酸乙酯，并以均質(zhì)機(jī)均 質(zhì)約 1 分鐘，再震蕩約 30 秒。b. 離心10分鐘（3000rpm），取2ml上清液（乙酸乙酯）至玻璃管中，于50oC下氮 氣吹干。c. 于此玻璃管中加入正己烷2 ml，先將殘余物完全溶解后（若未能完全溶解，可 能會導(dǎo)致回收率降低 ） ，再加入 1 ml 萃取稀釋液，震蕩約 30 秒鐘。d. 離心10分鐘（3000 rpm），用吸管吸去上層液（正己烷）及中間乳化層部分，棄 掉。再吸取下

15、層液 （水層）備用。e. 若有乳化現(xiàn)象，請先將大部分上層液 （正己烷）取出后，再將玻璃管置入 80oC 水中，隔水加熱約 510分鐘，可改善乳化情形。待測物為血清、則依以下方法 進(jìn)行處理5. 待測物為內(nèi)臟 （肝、心等），則依以下方法進(jìn)行處理 （5 倍稀釋）同上述步驟ad,但下層液吸出后，再以萃取稀釋液稀釋 5倍（即下層液50ul加 萃取稀釋液 200ml）。6. 待測物為飼料，則依以下方法進(jìn)行處理 （10 倍稀釋）同上述步驟ad，但下層液吸出后，再以萃取稀釋液稀釋10倍（即下層液30ul加萃取稀釋液 270ml）。C、操作步驟 本產(chǎn)品的酶標(biāo)記物與氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液均直接使用，無需再稀釋。1、于適當(dāng)

16、微孔中分別加入100mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（0,和。2、在另外的微孔中加入 100mL 已完成前處理的樣品溶液。3、再于每一微孔中另再加入50mL酶標(biāo)記物。4、 輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育1 小時。5、 將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。8、于室溫下避光靜置溫育 20 分鐘。9、于每一微孔中加入100mL反應(yīng)終止液。10、用酶標(biāo)儀于波長450nm下判讀。D判定1. 計算B/B0值。用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值（B）除以零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值（B0）再乘以 100%

17、。2. 以 B/B0 值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)半對數(shù)曲線。3. 根據(jù)每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度。4. 由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘 以其稀釋倍數(shù)。E、標(biāo)準(zhǔn)曲線F、靈敏度氯霉素試劑檢測盒的平均檢測下限為 ，此濃度之吸光值與陰性標(biāo)準(zhǔn)溶液 （0ppb） 之吸光值有明顯的差異。G、特異性針對以下抗生素進(jìn)行交叉反應(yīng)之測試，結(jié)果如下：Chloramphenicol =100%Chloramphenicol（free base） <%Gentamycin <%Tetracycline <%Penicill

18、in G <%Sulfamethazine <%H、再現(xiàn)性針對氯霉素檢測試劑盒精密度測試， 重復(fù) 6 次，所得不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值 變異系數(shù)（CV如圖2所示，顯示氯霉素試劑盒有很高的再現(xiàn)性：I 、回收率生乳（添加 104117%蜂蜜（添加 90110%蝦及魚肉（添加 95110%雞肉（添加 90120%血清（添加 100120%內(nèi)臟（添加 100120%飼料（添加 80110%氯霉素檢測試劑盒簡介氯霉素 （Chloramphenicol） 是一 種廣譜抗生素。由于其具有效果好以及價格低廉 等優(yōu)點(diǎn)，目前已被普遍應(yīng)用于各類家禽、 家畜、水產(chǎn)品及蜂制品的各種傳染性疾 病的治療。然而氯霉素有其嚴(yán)重的副作用 , 它會抑制人體骨髓的造血功能，從而 引起再生障礙性貧血和粒細(xì)胞缺乏癥。目前，我國已禁止其使用。我公司采用國內(nèi)外先進(jìn)的工藝與技術(shù)， 研發(fā)出氯霉素ELISA檢測試劑