人源重組蛋白藥物安全性評價的主要問題

1、Chinese Journal of Ne w D rugs 2009, 18(161486中國新藥雜志 2009年第 18卷第 16期作者簡介 盧覓佳 , 女 , 博士 , 研究方向 :基因工程藥物臨床前安全性評價 。 聯(lián)系電話 :(0571 87568012, E 2mail:lum ijiasina . com 。通訊作者 宣堯仙 , 女 , 研究員 , 碩士生導(dǎo)師 , 研究方向 :藥理毒理學(xué)。 聯(lián)系電話 :(0571 87568016, E 2mail:nndsvcmail. hz . zj . cn 。 新藥研發(fā)論壇 人源重組蛋白藥物安全性評價的主要問題盧覓佳 , 楊紅忠 , 吳友蘋

2、 , 陳 穎 , 宣堯仙(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心 , 杭州 310013 摘要 人源重組蛋白類新藥物因與小分子化藥在生產(chǎn)方式 、 分子構(gòu)成和藥理作用等多方面的差異 , 在其臨床前安全性評價研究過程中出現(xiàn)了一些新的問題 , 如相關(guān)動物種屬的選擇 、 劑量設(shè)置 、 試驗過程中受 試物免疫原性的干擾以及恰當(dāng)?shù)亩纠韺W(xué)檢測方法等 。 筆者綜合該類新藥在國內(nèi)外的安全性評價研究進(jìn)展和 在實際工作中遇到的難點和解決方法 , 如重組人干擾素的相關(guān)動物選擇 、 重組人胰島素的劑量設(shè)定 、 重組人 白介素 1受體阻滯劑的免疫復(fù)合物檢測等 , 對上述問題進(jìn)行了初步探討 。關(guān)鍵詞 人源重組蛋白藥物 ; 新藥

3、 ; 安全性評價 ; 相關(guān)動物 ; 劑量 ; 免疫原性中圖分類號 R965. 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 C 文章編號 1003-3734(2009 16-1486-04Con si dera ti on s on s afety eva lua ti on of human 2der recom b i n an t LU M i 2jia, Y ANG Hong 2zhong,WU xian(Center for Safety S tudy and Evaluation, l Hangzhou 310013, China Abstract There in of hu man 2derived rec

4、ombinant p r otein drugs be 2cause of the che m ical drugs, such as p r oducti on, molecular construct and phar macol . p m s include relative ani m al, dosage, interference due t o the drug s i m munoge 2necity during ons, and the app r op riate methods of t oxicol ogical detecti on . Based on inte

5、rnati onal p r o 2gress and the questi ons e merged in our laborat ory in safety evaluati ons of recombinant p r otein drugs, we discussed the issues, such as selecti on of relative ani m al for rhu 2I F N , dosage of rhu 2insulin and detecti on of i m mune comp lex induced by rhu I L 21Ra .Key word

6、s hu man 2derived reco mbinant p r otein; ne w drug; safety evaluati on; relative ani m al; dose; i m 2munogenecity 隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入 , 生物技術(shù)藥 物 (bi ophar maceutical 在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出蓬勃興 起的態(tài)勢 , 為多種疾病開辟了新的治療途徑 。重組 人干擾素 (rh I F N 、 重組人白介素 (rh I L 、 重組人胰 島素 (I nsulin 和重組人促紅細(xì)胞生成素 (rhEP O 等 均已于上世紀(jì)末在國內(nèi)上市 。 該類新藥進(jìn)入臨床前

7、安全性評價的數(shù)量亦逐年遞增 , 但回顧多種重組蛋白 /多肽的安全性研究 , 或多或少都受到了小分子化學(xué)藥物毒理學(xué)評價體系的影響 , 而忽視了重組蛋白 的獨特屬性 。體外合成的人用重組蛋白 /多肽在分子構(gòu)成 、 藥 效學(xué)機(jī)制和體內(nèi)代謝途徑等方面與化藥的不同之處 已有多篇文獻(xiàn)述及 , 新藥非臨床研究領(lǐng)域?qū)χ阎?漸形成了 “ 具體問題具體分析 (case by case ” 的安 評原則 。 筆者通過國內(nèi)外研究進(jìn)展 , 結(jié)合近年來在 工作中遇到的問題 , 對該類新藥安全性評價中的難 點和疑點作如下探討 。 Chinese Journal of Ne w D rugs 2009, 18(161487

8、 中國新藥雜志 2009年第 18卷第 16期1 動物種屬 /模型的選擇雖然動物體內(nèi)的許多受體對存在部分差異的人 源性配體有一定的寬容性 , 可與之結(jié)合并激活下游信號 (如 hEP O , h I L 21和 h I L 21Ra , 但許多生物技術(shù) 藥物仍有一定的種屬特異性 , 其生物活性需在特定 種屬的動物體內(nèi)才能體現(xiàn) , 毒理學(xué)研究中常用的 Beagle 犬和 S D 大鼠未必是最適宜的實驗動物 :重組人生長因子 2集 落刺激因子融合蛋白在猴和犬實驗 中表現(xiàn)出毒性差異1; rhEP O 則在人 、 猴和大鼠體內(nèi)表現(xiàn)出不同的生物利用度特點 2。某一重組蛋白 受試物的相關(guān)動物可通過其藥效學(xué)資

9、料或同類產(chǎn)品 的毒理學(xué)資料獲得 , 但當(dāng)上述資料缺乏時 , 則需在毒性試 驗 開 始 前 通 過 體 內(nèi) (in vivo 和 /或 體 外 (invitro 途徑來證實受試物的生物活性 , 如本實驗室利用血糖測試儀證實重組人胰島素可在 S D 大鼠體內(nèi) 引起明顯的血糖下降 、 rhu I F N 則在非洲綠猴腎細(xì)胞 (Ver o 、 犬腎細(xì)胞 (MDCK 和幼倉鼠腎細(xì)胞 (BHK 顯示出抗單純皰疹病毒 (SHV 的生物活性 , 據(jù)此 , 我們分別應(yīng)用 S D 大鼠和食蟹猴完成了上述 2種新 藥的毒理學(xué)研究 。 , 的 “ 無毒 ” 或 “ 低毒 ” , 2 多數(shù)情況下實驗動物可耐受最大給藥量

10、的重組 蛋白 , 因此在生物藥物安評早期 , 往往將高劑量組設(shè) 為最大給藥量來實現(xiàn)高暴露量 。 為恰當(dāng)?shù)伢w現(xiàn)藥物 的毒性作用 、 避免不必要的浪費(fèi) (該類新藥的生產(chǎn) 成本較高 , 劑量設(shè)置應(yīng)建立在對藥物作用機(jī)制充 分認(rèn)識的基礎(chǔ)上 。2. 1 給藥途徑與相對分子質(zhì)量因胃腸道的蛋白酶活性和黏膜對水溶性大分子 的吸收屏障作用 , 重組蛋白類藥物通常不用口服途 徑3。 靜脈注射可保證受試物以最大濃度進(jìn)入生物系統(tǒng) , 而經(jīng)皮注或肌注的受試物進(jìn)入血液循環(huán)的 數(shù)量受制于其相對分子質(zhì)量 :16103以上的大分 子主要被淋巴系統(tǒng)吸收 , 小于 1000的則主要吸收 入血液4。2. 2 受試物與動物細(xì)胞的親和力及

11、結(jié)合的可飽和性受試物只有在與其受體結(jié)合后才能發(fā)揮藥效及 與藥效相關(guān)的毒性反應(yīng) , 當(dāng)受試物在相關(guān)動物體內(nèi)或來源于該種動物的體外培養(yǎng)細(xì)胞上的親和力明顯 低于人體細(xì)胞時 , 有必要通過增加給藥量來彌補(bǔ)暴 露量的不足 5。某些受體的數(shù)量和分布有限 , 如EP O 受體 (EP OR 只存在于骨髓中的紅系細(xì)胞表 面 , 與 EP O 結(jié)合 、 啟動生紅細(xì)胞過程后 , EP O 2EP OR 復(fù)合體被細(xì)胞內(nèi)化 , 并在溶酶體中降解 6-7, 有研究表明 , rhuEP O 在大鼠骨髓中的內(nèi)化 2清 除過程是可 飽和的8。 因此 , 當(dāng)大量給予受體能力有限的受試物如促血小板生成素 (TP O 9, I F

12、 N 210以及白血 病抑制因子 11并不能通過增強(qiáng)其生物活性來體現(xiàn)毒副反應(yīng) 。2. 3 受試物濃度對受體數(shù)量的影響血循環(huán)中的胰島素濃度越高 , 則肝 、 脂肪 、 肌肉 和血細(xì)胞的胰島素受體數(shù)目越少 。 胰島素濃度過高 時可加速受體損失 , 造成原有糖代謝的紊亂 。在本 實驗室完成的重組人胰島素 (rhu ns 大鼠毒性試驗中 , 首次給予 (s . c 120, 60, -1rhu 2I ns 后在 55m in 降至 2. L - (s . c 50, 20, 8-1I , , 個; 8u kg-1rhu 2I ns 則在穩(wěn)定降, 且無不良反應(yīng) 。由此可 見 , 在 50u kg -1可

13、產(chǎn)生明顯的生物活性及其相關(guān)毒 性時 , 沒有必要將給藥量增至 120u kg -1。 3 人源蛋白在試驗動物體內(nèi)的免疫原性 (i m m uno 2gen i c ity種間差異決定了人用重組蛋白 /多肽與實驗動 物體內(nèi)的同源蛋白存在不同程度的序列和構(gòu)象差 異 , 即使是在多種動物間有著較高保守性的 EPO(人與大鼠 EPO 成熟肽的保守性為 82%, 人與猴 之間有 92%的氨基酸相似性 , 仍可被其他種屬動 物的 免 疫 系 統(tǒng) 識 別 而 誘 生 抗 體 (包 括 中 和 抗 體 12-14, 這種由受試物異源性引起的體液和 /或細(xì)胞免疫應(yīng)答將從不同方面影響生物藥物的臨床前 安全性評價

14、。3. 1 與藥效學(xué)無關(guān)的毒副反應(yīng)包括免疫相關(guān)組織的增生 、 抗藥物抗體 (anti 2drug antibodies, ADA 引起的免疫復(fù)合物 (I C 沉積 、 ADA 與相應(yīng)內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)引起的自身免疫疾病以及細(xì)胞免疫應(yīng)答導(dǎo)致的局部組織損傷等 。 重組人酸性成纖維細(xì)胞生長因子 (rhaFGF 連續(xù) 28d 涂抹家兔破損皮膚后發(fā)現(xiàn)免疫器官有明顯病理學(xué)改 Chinese Journal of Ne w D rugs 2009, 18(161488中國新藥雜志 2009年第 18卷第 16期變15; 促血小板生成素抗體經(jīng)交叉反應(yīng)引起的血小板減少癥 、 rhuEP O 抗體致貧血及 hu

15、G M 2CSF 抗體致 肺泡內(nèi)蛋白沉積也已見諸報道 12, 16-18。3. 2 免疫原性評價方法免疫原性不僅只是 ADA 的檢測 , 同時也包括中 和抗體 、 I C 及 ADA 的交叉反應(yīng)性等方面 。 3. 2. 1 ADA ?？赏ㄟ^間接 EL I S A 法在定期采集的動物血清中檢出 , 但得出的 ADA 效價常被作為中 和抗體滴度 , 即結(jié)合抗體和中和抗體概念的混淆 。 事實上 ADA 中只有一部分為中和性抗體 (或根本 無中和性 , 它通過特異性結(jié)合藥物的受體結(jié)合位 點而阻斷藥物的生物學(xué)活性 , 其滴度須通過專門的 生物活性檢測手段來體現(xiàn) , 如 rhu I F N 中和抗體可削

16、弱 rhu I F N 在體外 培養(yǎng) 細(xì)胞上 的抗 病毒作 用19;rhu I L 21中和抗體可削弱 rhu I L 21在體外培養(yǎng)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞上的促增殖作用 ; rhuEP O 中和抗體則可 降低 EP O 依賴性細(xì)胞 HCD57(+ 的生長速率 。筆 者正在進(jìn)行的一項重組人白介 素 1受 體阻 滯劑 (rhu I L 21Ra 免疫原性試驗中 , 以人黑色素瘤細(xì)胞株 (A357. S2 為觀察對象 , rhu I L 21Ra 拯救被 rhu I L 21中和性 。3. 2. 2 I C I C 疫復(fù)合物 , rhu I L 21Ra 血清中 I L 21Ra 制備人工免疫復(fù)合物 (

17、A I C , 作為 C I C 檢測中的陽性對照 , 并通過雙抗夾 心法成功地測得了給藥 6個月和停藥 1個月后大鼠 體內(nèi)的 C I C 。同時利用冰凍切片 2熒 光免疫組化方 法 , 揭示了沉積在給藥動物腎小球毛細(xì)血管基底膜 上的 I C 。3. 2. 3 ADA 的交叉反應(yīng)性 當(dāng)動物自身蛋白與受試物有一定程度的同源性和構(gòu)象相似性時 , ADA (包括中和性 ADA 除了與受試物結(jié)合外 , 也會與試 驗動物的同源蛋白結(jié)合 , 從而影響其正常地結(jié)合于 受體和代謝過程 , 如 EP O 基因治療引起猴的自身免 疫性貧血12。 針對交叉反應(yīng)的專門研究并不多見 , 筆者認(rèn)為 , 判斷依據(jù)主要有 :

18、 蛋白質(zhì)分析軟件推 測動物內(nèi)源蛋白和受試蛋白的序列同源性 、 T/B細(xì) 胞表位 、 受體結(jié)合位點 , 以此預(yù)測交叉反應(yīng)的可能 性 。 監(jiān)測 ADA 出現(xiàn)后受試物生物活性相關(guān)的臨 床反應(yīng) /血液 /生化指標(biāo) 。 ADA 注射未給藥正常 動物引起的相關(guān)臨床反應(yīng) /血液 /生化指標(biāo) 。3. 3 對毒代動力學(xué) (Tox i cok i n eti cs, TK 和藥效學(xué)的影響I CH 建議在重復(fù)給藥毒性試驗中進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)和毒物代謝動力學(xué)研究來評價重組蛋白在動 物體內(nèi)的暴露 (Exposure 水平 , 但包括重組蛋白在 內(nèi)的生物技術(shù)藥物的 TK 研究歷史不長20-21。在單次給藥或重復(fù)給藥試驗的

19、首次 , 動物體內(nèi)沒有 針對受試物的 ADA , 根據(jù)不同的給藥方式 , 除少部 分受試物被抗原遞呈細(xì)胞捕獲并加工外 , 其他應(yīng) 以正常的速度到達(dá)各靶細(xì)胞上的受體上 。但當(dāng)體 內(nèi)已有 ADA 存在時 , 受試物將首先與循環(huán)血中的 ADA 結(jié)合 , 其與受體結(jié)合及從血漿中清除的速度在很大程度上取決于血液中的抗體量和抗 體的 (非 中和性 。中和性 ADA 可通過加快藥物清除 速率或屏蔽藥物的受體結(jié)合位點來改變 TK 和藥 效學(xué)參數(shù)22, 頻率和嚴(yán)重程度 、 , 在進(jìn)行 TK, ADA 后 , 應(yīng)以 TK 參數(shù) , 以此作為試驗繼續(xù)或 。3. 4 免疫原性在毒理學(xué)研究中的意義免疫應(yīng)答檢測已成為毒理

20、學(xué)評價中不可回避的 環(huán)節(jié)24-25, 重復(fù)給藥毒性試驗中檢測到的 ADA 并不是中斷給藥的合理依據(jù) , 除非能證實其中含有能 中和藥物藥理和 /或毒理作用的中和抗體5。免疫原性結(jié)果并不是用于簡單地外推到人體反應(yīng) , 而是 當(dāng)出現(xiàn) “ 無毒性反應(yīng) ” 或與藥理作用明顯無關(guān)的“ 新 毒性效應(yīng) ” 時 , 對最終評價結(jié)果進(jìn)行合理和必要的 補(bǔ)充說明 , 以此為依據(jù)來判斷是否要進(jìn)行更深入的 無免疫原性干擾的毒理學(xué)研究 , 如利用對受試物無 免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物或動物體內(nèi)的受試物同源蛋 白來進(jìn)行毒性研究 1, 26-27。4 結(jié)語重組蛋白類藥物是模擬人體蛋白質(zhì)在體外培養(yǎng) 細(xì)胞中合成的分子 , 與化學(xué)合成藥

21、相比 , 是一種歷史 較短的藥物 。最初人們認(rèn)為既然該類藥物源自人 體 , 就應(yīng)該是安全的 , 但事實并非如此 。 雖然國內(nèi)外 藥審機(jī)構(gòu)針對這類新藥頒布了一系列臨床前研究指 導(dǎo)原則 , 但具體研究方案仍需要針對受試物特性來 制定 , 廣大毒理學(xué)工作者在多年實踐中不斷深化 Chinese Journal of Ne w D rugs 2009, 18(161489 中國新藥雜志 2009年第 18卷第 16期和完善著這一領(lǐng)域的研究 , 為人類的安全用藥做 出貢獻(xiàn) 。 參 考 文 獻(xiàn) 1 KELLER P, S MALL I N G R. Granul ocyte col ony sti m ul

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