qPCR操作步驟教學(xué)文案

1、qPCR操作步驟具體的操作步驟是，RNA 提取，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 10 倍稀木 I,real-timePCR.這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)的兩步法。一步法是把反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增聯(lián)合起來做，不推薦使用。具體的注意事項(xiàng)有1:高質(zhì)量的 RNA 獲取，這里的高質(zhì)量不是強(qiáng)調(diào) RNA 降解，而是強(qiáng)調(diào) RNA 的純度，不能含有基因組DNA,以及其他雜質(zhì)污染?；蚪M DNA 的存在會(huì)導(dǎo)致定量偏高，給你錯(cuò)誤的結(jié)果，所以一般用于定量 PCR 的 RNA 必須使用 DNase 處理，消除 DNA 污染。而 RNA 中的雜質(zhì)的污染會(huì)限制 real-timePCR 的反應(yīng)，導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，給你假陰性的結(jié)果。RNA 的降解不是關(guān)鍵，一個(gè)

2、是因?yàn)槎?PCR 的引物擴(kuò)增目的長度本身很短，150-250 個(gè) bp,并不用于擴(kuò)增目標(biāo)基因的全長。此外是因?yàn)榇嬖趦?nèi)參基因，所以 RNA 降解會(huì)通過內(nèi)參基因的測定來平衡。畢竟一旦發(fā)生降解，所有的 RNA 以同樣的速度降解，而相對(duì)比率不會(huì)改變。2：減少加樣誤差，在使用 SYBRGreenMIX 的時(shí)候，一定要先按照反應(yīng)的量（比如 8 個(gè)孔）把所有的試劑一次性配成 MIX 然后分裝，留出 5 微升的反應(yīng)體系給模板，為什么要使用 5 微升，是因?yàn)橹挥?5 微升以上，加樣槍的誤差才會(huì)比較小，如果你僅僅是吸取一微升的話，手重一點(diǎn)或者輕一點(diǎn)都會(huì)造成極大的加樣誤差，嚴(yán)重影響你的定量精確度。3。選擇合適的內(nèi)

3、參基因，一般用于定量 PCR 的內(nèi)參基因有好幾種，但卻沒有完全通用的內(nèi)參基因。具體到不同來源的細(xì)胞，比如不同組織來源，或者是動(dòng)物等等，內(nèi)參基因會(huì)有差異，最好的辦法是，在你的樣品上先測試內(nèi)參基因，找到變化最小，最穩(wěn)定的一個(gè)。4。合適的引物設(shè)計(jì)，避免出現(xiàn)引物二聚體，非特異性擴(kuò)增等等Q-PCR 實(shí)驗(yàn)流程一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開 15-20分鐘。超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA 抽提需帶口罩。取 EP 管/槍頭時(shí)需用銀子，不可以用使用過的手套直接取用。取完 EP 管/槍頭后，袋子及時(shí)封好。橡膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過程中不得

4、帶出超凈臺(tái)，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用 75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺(tái)面。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒有帶口罩不要在超凈臺(tái)前講話。總 RNA 抽提1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用 1*PBS 洗兩次后，用 1ml 槍將 PBS 吸干凈，加入1mlTrizol（inv 計(jì) rogen）溶液，吹打混勻，并吸至 1.5mlRNasefreeEP 管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置 5min;組織樣品用液氮充分研磨，加入 1mlTrizol（Invitrogen）溶液，混勻，室溫放置 5min 使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱）2）加入 200 小氟仿，劇烈振蕩混勻 30s,使水

5、相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min;（離心時(shí)離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，與第一步的順序一致）3）4c 下，14,000g 離心 15min,可見分為三層，RNA 在上層水相，移至另一個(gè)新的 RNasefreeEP 管;（用 20-200ul 的槍吸取上清，吸上清時(shí)，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）4）沉淀 RNA:加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒 6-8 次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置 10min;5）4C 下，14,000g 離心 10min,收集 RNA 沉淀（如離心后仍不見 EP 管底部有沉淀，應(yīng)將 EP 管放置在-80 度

6、冰箱過夜，繼續(xù)在 4c 下，14,000g 離心 10min,收集 RNA沉淀），去上清；6）用 75%乙醇洗滌兩次（12,000g 離心 5min）（加入乙醇后只需輕輕顛倒 EP 管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺(tái)風(fēng)干；沉淀不能過干或過濕，過干則不易溶解，過濕則乙醇?xì)埩簟?）視沉淀量加入適量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀、去基因組使用 RNase-free 的 DNase?（Promega）,按以下體系配置反應(yīng)液，37c 消化 30min,65c 滅活 10min。RNA30plDNase?20pl10 xbuffer10plH2O(RNasefree)39.5plRN

7、asin0.5pl總體積100pl然后按以下步驟操作：1）加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置 5min,后14,000rpm,離心 15min,取上清。2）加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后 14,000rpm,離心 15min,取上清。3）加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒 6-8 次），-20C 靜置 15min;4）4C 下，14,000g 離心 15min,收集 RNA 沉淀，去上清;5）用 75%乙醇洗滌兩次（12,000g 離心 5min）,超凈臺(tái)風(fēng)干；6）加入適量 DEPC 水（至少 15ul）溶解沉淀。四、總 RNA 純度和完整性檢測1）純度檢測：取 1

8、 卜 lRNA 樣品 50 倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定 OD 值，OD260/OD280 的比值大于 1.8,說明制備的 RNA 較純，無蛋白質(zhì)污染。2） 總RNA完整性檢測： 取RNA樣品1J1%瓊脂糖凝膠電泳80VX20min,EB染色10min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總 RNA 的 5srRNA,18srRNA 和 28srRNA 條帶，三條條帶完整的話即可證明總 RNA 抽提比較完整。五、逆轉(zhuǎn)錄1.mRNA:1）在 RNasefree 的 PCR 管中配置下列溶液.TotalRNAH2O1.02）將上述溶液吹打均勻，置 85C 保溫 5min,使 RNA 變性。隨后立即冰上致總

9、體積12冷，以防止 RNA 復(fù)性；3）在該 PCR 管中加入下列試劑（Promega）oligo(dT)0.5Randomprimer0.510mMdNTP2.0RNaseinhibitor0.55xbuffer4.0M-MLV0.5yl總體積8.0J4)將上述 20 小吱應(yīng)?液 30c 保溫 10min;5) 42C 保溫 50min;6) 85C 保溫 10min;7)-20C 保存。2. microRNA:使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖：1）在去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液totalRNAX 個(gè) miR 逆轉(zhuǎn)錄引物H2O1.00.5*X聞總體積12.5RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)。隨后立

10、即置于冰上，以防止 RNA 復(fù)性再次恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)3）在另一去 RNase 的 PCR 管中配置以下溶液:10mMdNTP(promega)2.0plRNaseinhibitor(promega)0.5plU6 逆轉(zhuǎn)錄引物0.5pl5xbuffer4.0plM-MLV(promega)0.5pl總體積7.5pl4）將 3）溶液加入到 1）溶液中，混勻后 30c 保溫 10min;5） 42c 孵育 50min;6） 85c 孵育 10min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶四、定量 PCR 檢測1 .引物測試：根據(jù) mRNA 設(shè)計(jì)的引物正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行 qPCR 測試其特異性和擴(kuò)增效率， 具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如正

11、式實(shí)驗(yàn)，每對(duì)引物需做模板水對(duì)照得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：單峰且峰形偏窄、水對(duì)照無明顯引物二聚體熔解曲線峰。若設(shè)計(jì)的多對(duì)引物熔解曲線均顯示特異性良好，則應(yīng)對(duì)比各引物的擴(kuò)增曲線，優(yōu)先選擇 Ct 值小、擴(kuò)增效率高的引物進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。2 .確定上機(jī)內(nèi)容后，首先在記錄本上編排好上機(jī)的樣品排放順序。(1)一個(gè)樣品的加樣盡可能安排在同一行(2)如正式實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)不能安排在同一板上，則2）將上述溶液混勻，85c 孵育 5min,以打開需把三次重復(fù)中的實(shí)驗(yàn)分開，但同一次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)不能分開兩板3 .正式實(shí)驗(yàn)：體系配制：H2O4ulSYBRGreenPCRMasterMix10ul(

12、TOYOBO)(使用前需振蕩均勻)上游引物 0.5ul(10uM)下游引物 0.5ul(10uM)總體積 15ul計(jì)算好實(shí)驗(yàn)中需用多少份體系，則按具體量配置。體系分裝會(huì)有損失，一般多配0.5 份-1 份體系。總的體系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻，然后 15ul 每管分裝至8 連管中。3 .CDNA 用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛龋话銥?1:20 稀釋，如遇到基因表達(dá)低的樣品，則適當(dāng)降低稀釋比例至 1:10 或 1:5。cDNA 按一定順序排好后，即可加至剛配好的反應(yīng)體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標(biāo)記好 1-12 的順序（不可將標(biāo)記寫在反應(yīng)管的蓋子上，八連管蓋避

13、免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域，且保證每孔均蓋緊，否則影響重復(fù)性或可能出現(xiàn)熔解曲線峰漂移。）4.把各排八連管放在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒。五.上機(jī)：5.1 先開電腦，進(jìn)入 Windows 界面。接著打開 PCR 儀電源開關(guān)。5.2 打開 7500 軟件，選擇新建”，在“Template 下拉菜單中選擇“6 哦“65 普通基因檢測為“6Q”MicroRNA 檢測為“65”）5.3 打開樣品架，放入八連管，關(guān)上樣品架，并在軟件上選擇已放反應(yīng)管的孔位，剔除無反應(yīng)管的孔位。5.4 點(diǎn)擊 File 菜單中 Save,輸入要保存結(jié)果的文件名，命名為日期-上機(jī)時(shí)間-客戶名字簡寫，如 100830-1008-WL 表示 8 月 30 日 10 點(diǎn) 0