提取基因試劑總結(jié)與每步驟原理、作用

1、第一部分：質(zhì)粒DNA提取中各種試劑的作用說明卩 細(xì)胞的裂解：* 裂解液I 50nonolA葡萄糖卩25nanol ATris-Cl （pH8. 0）召 10iranolAEDTA（pH8.欲用柱層析逬一步純化所制備的質(zhì)粒DNA,無菌的堿裂解液I在使用前可補(bǔ) 充以適當(dāng)體積的去DNA酶的RNA酶A（20wg/nil）,使之終濃度為lOOug/ml.欲用 其他的方法純化DNA,則不推薦在此步驟添加RNA酶。4葡萄癮 增加瘩液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解"EDTA：螯合N尹、C尹等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解多用卄裂解液II0. 2N NaOHdSDSu

2、旳0H,核酸在pH大于5、小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或PH<3 時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變形。在溶液II中旳N&OH濃度為0. 2mol/L, 加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12. 6,因而促進(jìn)染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性異SDS；是離子型表面活性劑。它的主要功能有；（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與 蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。G） SDS能與 蛋白質(zhì)結(jié)合稱為ROSOLF謹(jǐn)白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但 是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在姻的提取過程中,必須把它去除干掙， 防止在下一步操作中（用Rnase去除R

3、NA時(shí)）受到干擾卩A裂解液III5mol幾乙酸鈉60. 0ml*3冰乙酸（!） Il5m2H=O 28. 5mlNaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至48,必須加入大量的冰醋酸。所以 該溶液實(shí)際上是NaAc-Hac的緩沖液。用pH4.呂的pH至4. 8是為了把pH12. 6的 抽提液調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的 NaAc有利于變性的大分子染色體DNA. RNA以及SDS囑白復(fù)合體凝聚而沉淀之。 前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力耐目互聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS- 蛋白復(fù)合體作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。a質(zhì)粒DNA的回收=3無水乙

4、醇的作用：沉淀DNAuTE緩沖液：（滅菌）“25mol/L Tris-HCL Ct>H7. 5）v 30niTOL/L EDTA緩沖液a 用于洗脫（提?。┖捅４鍰NM第二部分：DNA提取中其他試劑我1. TE： Tris-HCREDTA pH 為心Tris HCL維持pH的穩(wěn)定，為溶菌酶提供合適的pHd 用Tri,調(diào)節(jié)至pH為&是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或碗性條件下 CpH57),RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA 彳羊品6 *EDTLV (1)螯合Mg2+、62 +等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA 的降解作用(DNase作用時(shí)需要

5、一定的金屬離子作輔基)；2)EDTA的存在， 有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的壞境。ED1A還可以螯合維持細(xì)胞壁穩(wěn)定性的CQ+,使細(xì)胞壁不穩(wěn)定。卩2. 溶菌酶z它是糖彗水解酶.能水解菌體細(xì)胞壁的主妾化學(xué)成分駄聚糖中的 ?4,4糖昔犍，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受 到抑制° 33. SDS； SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有；亠(1) 溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜?！?2) 解聚細(xì)胞中的核蛋白。屮SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。屮 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取

6、過程中，必須把它去除 干掙，防止在下一步操作中(ffl RNase去除RNA時(shí))受到干擾4. 蛋白菌監(jiān)蛋白酶K是一種非特異性、枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶， 具有很高的比活性。EDTA等鰲合劑或SDS等去垢劑不能使蛋白酶K失活， 反而增強(qiáng)和穩(wěn)定酶活性。在組織或細(xì)胞核酸分離時(shí)，它使核酸酶(RNase和 DNase )以及反應(yīng)中的其他酶類失活以及降解蛋白質(zhì)。心5. 5M NaCl：沉淀DNA吋總會(huì)加入高濃度的鹽如鹽的目的是破壞能使蛋白質(zhì) 保持穩(wěn)定的兩個(gè)因素，使蛋.白和DNA分離并沉淀下來而此時(shí)鹽的陽離子會(huì)與 DNA結(jié)合形成DNA-陽離子鹽溶于溶液中，再用無水乙醇可以將DNA-陽離子 鹽沉淀下來

7、但這樣一來QNA中就含有較多的鹽離子，這勢必會(huì)影響下一歩實(shí) 驗(yàn)的進(jìn)行所以要用70%乙醇洗櫬DNA沅淀(因?yàn)樵?0%乙醇里DNA是不溶 的而鹽離子卻可溶)用無水乙醇則達(dá)不到這個(gè)目的卩6. 酚:氯仿=異戊醇(25:24:1)酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍妆芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白 質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去,使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心, 變性蛋白質(zhì)的密度比水的巒度為大，因而與水相分離，沉淀在朮相下面，從而與 溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。4 作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大, 但酚與水相有一定

8、程度的互溶，大約10%15%旳水溶解在酚相中，因而損失 了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作用不如酚效杲好，但氯仿與水不相混 溶，不會(huì)帶走DNAo所以在抽提過程中，混合使用酚與氯彷效果最好。經(jīng)酣第 一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯彷是互溶的，可用氯仿第二次變性 蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯偽混合(1:1) 使用。*異戊醇：在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合 液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡秣產(chǎn)生 一股采用氯仿與異戊酵為24 1之比， 也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為

9、25i 24:1不必先配制，可在臨用酣巴一份酚 加-24： I的氯仿與異戊醇即成二同時(shí)異戊醇有助于分相.使離心后的上層 水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。卩7. 稀釋調(diào)幣NaCl濃度（NsAg或NaCl至最塔蕭度達(dá)410.2SmoVLH在pH為&左右的榕液中QNA分子是帶員電荷的,加一定鞭度的NaAc或NaCL 使N廿中和DNA分子上的負(fù)電荷.誡少DNA分子之間的同性電荷相斥力.易 于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低吋，只有部分DNA 形成DNA鈉鹽而聚合，遠(yuǎn)祥就造成DNA沉淀不完全'當(dāng)刖入的鹽溶液派度太 髙時(shí)，其數(shù)果也不奸。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA 旳酶切等反應(yīng)，所以最后需要用70%的乙醇洗去多余的鹽 質(zhì)粒抽提時(shí)，瘩液3中含有大量的鹽，所以不必另外加扯8. 仏6倍體積異丙醇用乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法令乙醇的優(yōu)點(diǎn).乙醇與 核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng).對DNA很安全.因此是理想的沉淀劑。4DNA溶液是DN血以水臺狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí).如果用的是無水乙醇, 無水乙醇會(huì)奪去DNA周國的水分子，使DNA-fa離子鹽失爪，DNA分子之間就 容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀.一